【摘要】：纖維素酶是一類催化纖維素鏈β-1,4-糖苷鍵水解,是將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖、纖維二糖、纖維低聚糖的酶,傳統(tǒng)上將其分為三類:內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,纖維素酶可被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織、發(fā)酵等領(lǐng)域。纖維素酶來源十分廣泛,昆蟲、動物體、細(xì)菌、真菌等都能產(chǎn)生纖維素酶,且纖維素酶多來源于微生物,尤其是細(xì)菌與真菌。本課題以團(tuán)頭魴腸道菌株雪白曲霉MA35(Aspergillus niveus MA35)為出發(fā)菌株,通過發(fā)酵的方式生產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行分離純化,從中得到了一種內(nèi)切型纖維素酶,并且研究該酶的酶學(xué)性質(zhì),不僅對草食性魚類飼料配比的研究提供了一定的技術(shù)支持,也為構(gòu)建真菌纖維素酶工程菌種提供了優(yōu)良的基因源。本文采用硫酸銨分級沉淀,Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析等手段,從Aspergillus niveus MA35發(fā)酵菌體內(nèi)制備出了電泳純的纖維素酶制劑,比活力由5.97 U/mL提高到36.6 U/mL,純化倍數(shù)為6.13,回收率為34%,根據(jù)SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳推算可知,該酶分子量約為45 kD。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該內(nèi)切型纖維素酶水解底物羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的最適溫度和最適pH分別為45℃和4.5,米氏常數(shù)Km為5.92 mg/mL,最大反應(yīng)速度Vmax為1.72×10~(-1) mg/(mL·min)。酶穩(wěn)定性研究表明在溫度30~55℃以及pH4.0~8.0之間具有良好的穩(wěn)定性。研究各離子對酶活的影響,其中Cl~-,I~-,Br~-,Na~+,Li~+,K~+對酶活力沒有明顯影響;Zn~(2+),Mn~(2+)對酶活力有明顯地激活作用;Ca~(2+)在低濃度下對酶有輕微地激活作用,在高濃度下對酶沒有明顯地影響;重金屬離子Cu~(2+),Pb~(2+),Fe~(2+)對酶有強烈地抑制作用,對其抑制類型的研究表明這三種金屬離子對該酶的抑制為不可逆抑制。有機(jī)試劑對酶活力影響的研究表明,有機(jī)試劑乙醇、乙二醇、丙酮和苯酚對纖維素酶有強烈的抑制作用,其半抑制濃度分別為18.3%、8.3%、0.8%、0.5%,由此可判斷其中苯酚對酶的抑制作用最強,乙醇較輕微地對酶活有抑制作用,符合工業(yè)生產(chǎn)中利用醇沉法對蛋白質(zhì)(酶)進(jìn)行濃縮的普遍規(guī)律。再進(jìn)一步研究化學(xué)修飾劑(溴乙酸、二硫蘇糖醇、乙酸酐、苯甲基磺酰氟、對氯汞苯甲酸、過氧化氫、乙酰丙酮)對該酶的修飾作用,研究該酶活性中心的必需基團(tuán),結(jié)果表明組氨酸咪唑基與賴氨酸的ε-氨基是該酶活性中心的必需基團(tuán),巰基、精氨酸殘基、絲氨酸殘基和甲硫氨酸殘基不是該酶活性中心必需基團(tuán),二硫鍵與該酶活力無關(guān)。溴乙酸對纖維素酶的抑制作用為可逆混合型抑制,乙酸酐對該酶的抑制作用為不可逆非競爭性抑制。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章 緒論纖維素維素是一種由 D-葡萄糖苷以 β-1,4 糖苷鍵連接而成的線型同質(zhì)多聚物C6H10O5)n，聚合度約在 100-15000 個葡萄糖殘基[13, 14]，是世界上最豐物資源。其化學(xué)結(jié)構(gòu)通常有兩種表示方式，分別為 Haworth 結(jié)構(gòu)式和構(gòu)式（圖 1-1）。自然界中的纖維素主要存在于植物的細(xì)胞壁中，并且細(xì)菌以及被囊動物中也存在纖維素[14-18]。

酶酶的概念及分類可以催化纖維素鏈中 β-1,4-糖苷鍵水解，將纖維素轉(zhuǎn)化葡萄糖，根據(jù)不同機(jī)理分類有略微的差異，其中經(jīng)典分類是基域和底物特異性，將纖維素酶分為三種類型: β-1,4-內(nèi)切葡葡糖苷酶{非還原端纖維素水解酶(EC 3.2.1.91)、還原性末.2.1.176)、纖維素糊精酶(EC 3.2.1.74)}，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2先將纖維素水解為纖維二糖、纖維糊精以及其他纖維寡糖隨機(jī)水解纖維素鏈上的 β-1,4-糖苷鍵，，釋放出不同長度的寡二糖）。外切葡萄糖苷酶作用于纖維素的還原和非還原性末以及其他短寡糖，纖維糊精酶作用于可溶性物質(zhì)纖維寡糖后 β-葡萄糖苷酶進(jìn)行水解纖維糊精和纖維二糖轉(zhuǎn)化成葡萄作用于纖維素的示意圖如圖 1-2[27]所示。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2612216