甘油二酯是甘油上的兩個羥基與兩分子的脂肪酸酯化得到的產(chǎn)物,包括1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯兩種形式。其中,富含1,3-甘油二酯的油脂具有防止肥胖、降血脂、降血壓等多種生理功能,因而被認(rèn)為是“特定健康用食品”。同時,1,3-甘油二酯又是合成一些化合物(如結(jié)構(gòu)脂1,3-二油�；�-2-棕櫚酰甘油酯等)的重要原料。由于天然油脂中1,3-甘油二酯的含量很低,所以其催化合成的研究顯得尤為重要。在生物催化制備1,3-甘油二酯的研究中,往往由于酶的選擇性、酶活力、反應(yīng)程度和分離純化等方面存在一定的缺陷,導(dǎo)致產(chǎn)品中1,3-甘油二酯的含量較低,這嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用。�；w移現(xiàn)象普遍存在于甘油二酯的制備和儲存中。本論文首先研究了 1,3-甘油二酯在不同溫度下的酰基遷移情況,初步確定酶法制備1,3-甘油二酯的溫度為30℃。在此溫度下,研究了不同脂肪酶的區(qū)域選擇性,獲得在催化油酸與甘油的酯化反應(yīng)中具有最高的1,3-區(qū)域選擇性的脂肪酶ROL(Rhizopus oryzaelipase),其對1,3-甘油二酯的選擇性>97%。為強(qiáng)化脂肪酶ROL在油酸與甘油的酯化反應(yīng)體系中的催化性能和重復(fù)利用性能,...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 甘油二酯的概述
        1.1.1 甘油二酯的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 甘油二酯的營養(yǎng)價值及應(yīng)用
        1.1.3 1,3-甘油二酯的制備方法
            1.1.3.1 甘油解法制備1,3-甘油二酯
            1.1.3.2 水解法制備1,3-甘油二酯
            1.1.3.3 酯交換法制備1,3-甘油二酯
            1.1.3.4 酯化法制備1,3-甘油二酯
        1.1.4 甘油二酯的�；w移
    1.2 脂肪酶的概述
        1.2.1 脂肪酶概述
        1.2.2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征和催化機(jī)理
        1.2.3 脂肪酶的選擇性
            1.2.3.1 脂肪酸或�；w的選擇性
            1.2.3.2 區(qū)域或位置選擇性
            1.2.3.3 立體選擇性
        1.2.4 脂肪酶的界面激活效應(yīng)
    1.3 脂肪酶的固定化
        1.3.1 吸附法
        1.3.2 包埋法
        1.3.3 共價交聯(lián)法
        1.3.4 偶聯(lián)法
        1.3.5 納米材料在脂肪酶的固定化中的應(yīng)用
    1.4 脂肪酶的異源表達(dá)
    1.5 酶的熱穩(wěn)定性改造
        1.5.1 基于非理性設(shè)計(jì)的熱穩(wěn)定性改造
        1.5.2 基于半理性設(shè)計(jì)的熱穩(wěn)定性改造
        1.5.3 基于理性設(shè)計(jì)的熱穩(wěn)定性改造
            1.5.3.1 基于二硫鍵的理性設(shè)計(jì)
            1.5.3.2 基于同源比對的策略
            1.5.3.3 基于溫度因子的熱穩(wěn)定性改造
            1.5.3.4 基于氨基酸殘基極性的理性設(shè)計(jì)
            1.5.3.5 酶的熱穩(wěn)定性改造的常用軟件
        1.5.4 分子動力學(xué)的應(yīng)用
    1.6 本課題的研究思路與主要內(nèi)容
        1.6.1 研究思路
        1.6.2 研究內(nèi)容
第二章 高選擇性脂肪酶的篩選及其固定化
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料與試劑
        2.2.2 分析方法
            2.2.2.1 薄層層析法
            2.2.2.2 高效液相色譜法
            2.2.2.3 脂肪酶蛋白含量的測定
        2.2.3 高區(qū)域選擇性脂肪酶的篩選
            2.2.3.1 1,3-甘油二酯�；w移的研究
            2.2.3.2 脂肪酶的篩選
        2.2.4 脂肪酶的固定化
            2.2.4.1 納米四氧化三鐵的制備
            2.2.4.2 納米四氧化三鐵的表面修飾
            2.2.4.3 納米四氧化三鐵的表征
            2.2.4.4 脂肪酶的固定化
            2.2.4.5 脂肪酶活力的測定
        2.2.5 固定化脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
            2.2.5.1 pH對脂肪酶活力的影響
            2.2.5.2 游離酶和固定化酶的底物特異性
            2.2.5.3 游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性
            2.2.5.4 游離酶和固定化酶的動力學(xué)性質(zhì)研究
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 不同溫度下1,3-甘油二酯的酰基遷移
        2.3.2 脂肪酶的篩選
        2.3.3 脂肪酶ROL催化的油酸甘油的酯化反應(yīng)
        2.3.4 四氧化三鐵載體的制備與表征
            2.3.4.1 場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)分析
            2.3.4.2 傅利葉紅外光譜(FT-IR)分析
            2.3.4.3 X射線多晶衍射儀分析(XRD)分析
            2.3.4.4 磁學(xué)性質(zhì)分析
        2.3.5 脂肪酶ROL的固定化
            2.3.5.1 表面活性劑等添加劑對固定化的影響
            2.3.5.2 pH對固定化的影響
            2.3.5.3 蛋白質(zhì)濃度對固定化的影響
            2.3.5.4 蔗糖酯添加量對固定化的影響
            2.3.5.5 固定化時間對固定化的影響
        2.3.6 固定化酶和游離酶的性質(zhì)比較
            2.3.6.1 pH對游離酶和固定化酶比活力的影響
            2.3.6.2 固定化酶和游離酶的底物特異性比較
            2.3.6.3 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性比較
            2.3.6.4 固定化酶和游離酶的水解動力學(xué)研究
    2.4 本章小結(jié)
第三章 固定化脂肪酶催化制備高純度1,3-二油酸甘油酯
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料與試劑
        3.2.2 反應(yīng)裝置的設(shè)計(jì)
        3.2.3 固定化脂肪酶催化制備1,3-二油酸甘油酯的單因素優(yōu)化
        3.2.4 固定化酶的重復(fù)利用
        3.2.5 反應(yīng)產(chǎn)物的分離純化
            3.2.5.1 甲醇結(jié)晶法
            3.2.5.2 乙醇結(jié)晶法
            3.2.5.3 堿中和法
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 Fe₃O₄固定化酶制備高純度1,3-二油酸甘油酯
            3.3.1.1 不同摩爾比的油酸甘油對酯化反應(yīng)的影響
            3.3.1.2 溫度對酯化反應(yīng)的影響
            3.3.1.3 固定化酶的添加量對酯化反應(yīng)的影響
            3.3.1.4 除水方式對酯化反應(yīng)的影響
            3.3.1.5 反應(yīng)體系真空度對酯化反應(yīng)的影響
            3.3.1.6 攪拌速度對反應(yīng)的影響
            3.3.1.7 游離酶和固定化酶酯化效果的比較
        3.3.2 游離酶和固定化酶的重復(fù)利用性能
        3.3.3 酯化產(chǎn)物的分離純化
            3.3.3.1 結(jié)晶法
            3.3.3.2 堿中和法
    3.4 本章小結(jié)
第四章 脂肪酶ROL在畢赤酵母中的異源表達(dá)
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 質(zhì)粒和菌種
        4.2.2 試劑和試劑盒
        4.2.3 試劑的配制
        4.2.4 培養(yǎng)基的配制
        4.2.5 實(shí)驗(yàn)方法
            4.2.5.1 基因的獲取和密碼子優(yōu)化
            4.2.5.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
            4.2.5.3 線性化質(zhì)粒的準(zhǔn)備
            4.2.5.4 畢赤酵母感受態(tài)的制備
            4.2.5.5 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及篩選
            4.2.5.6 畢赤酵母重組子的驗(yàn)證
            4.2.5.7 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)
            4.2.5.8 畢赤酵母發(fā)酵液的酶活力測定
            4.2.5.9 SDS-PAGE蛋白電泳檢測
            4.2.5.10 重組脂肪酶的區(qū)域選擇性測定
            4.2.5.11 重組脂肪酶的性質(zhì)研究
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 密碼子的優(yōu)化結(jié)果
        4.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化結(jié)果
        4.3.4 脂肪酶ROL的異源表達(dá)結(jié)果
        4.3.5 重組脂肪酶ROL催化的區(qū)域選擇性
        4.3.6 脂肪酶ProROL的性質(zhì)研究
            4.3.6.1 脂肪酶ProROL的最適反應(yīng)pH
            4.3.6.2 脂肪酶ProROL的最適反應(yīng)溫度
            4.3.6.3 脂肪酶ProROL的熱穩(wěn)定性
            4.3.6.4 脂肪酶ProROL的溶劑耐受性
    4.4 本章小結(jié)
第五章 脂肪酶ROL的熱穩(wěn)定性改造及表達(dá)強(qiáng)化
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 質(zhì)粒和菌種
        5.2.2 試劑和試劑盒
        5.2.3 試劑的配制
        5.2.4 培養(yǎng)基的配制
        5.2.5 實(shí)驗(yàn)方法
            5.2.5.1 多序列比對
            5.2.5.2 二硫鍵的設(shè)計(jì)
            5.2.5.3 突變方法
            5.2.5.4 重組大腸桿菌的構(gòu)建
            5.2.5.5 重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝重組子的篩選
            5.2.5.6 脂肪酶ROL的誘導(dǎo)表達(dá)
            5.2.5.7 酶的熱穩(wěn)定性等性質(zhì)的測定
            5.2.5.8 突變體的同源建模
            5.2.5.9 脂肪酶ROL及其突變體的分子動力學(xué)(MD)模擬
            5.2.5.10 熱穩(wěn)定性強(qiáng)化的突變體的應(yīng)用初探
    5.3 結(jié)果和討論
        5.3.1 多序列比對結(jié)果
        5.3.2 基于同源建模的理論分析
        5.3.3 二硫鍵的理性設(shè)計(jì)
        5.3.4 ProROL和E190C/E238C在分子水平上的構(gòu)象變化
        5.3.5 通過熱點(diǎn)和二硫鍵的組合突變提高熱穩(wěn)定性
        5.3.6 四點(diǎn)組合突變體熱穩(wěn)定性提高的機(jī)理解釋
        5.3.7 四點(diǎn)突變體的酶學(xué)性質(zhì)
            5.3.7.1 最適pH
            5.3.7.2 最適反應(yīng)溫度
            5.3.7.3 溶劑耐受性
            5.3.7.4 動力學(xué)常數(shù)
        5.3.8 四點(diǎn)突變體高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選和誘導(dǎo)表達(dá)
            5.3.8.1 高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選
            5.3.8.2 不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.3.9 四點(diǎn)突變體的固定化和應(yīng)用初探
            5.3.9.1 四點(diǎn)突變體(V209L/D262G/E190C/E238C)的固定化
            5.3.9.2 四點(diǎn)突變體及其固定化酶的應(yīng)用
    5.4 本章小結(jié)
第六章 脂肪酶ROL的區(qū)域選擇性機(jī)制
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 口袋打開的脂肪酶結(jié)構(gòu)的同源建模
        6.2.2 蛋白和配體文件的準(zhǔn)備
        6.2.3 蛋白質(zhì)-配體的分子對接
        6.2.4 蛋白質(zhì)-配體的分子動力學(xué)(MD)模擬
        6.2.5 分子動力學(xué)計(jì)算結(jié)果的分析
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 脂肪酶ROL的同源建模
        6.3.2 脂肪酶ROL的區(qū)域選擇性機(jī)理解釋
            6.3.2.1 脂肪酶ROL與甘油二酯的分子對接
            6.3.2.2 酶與甘油二酯復(fù)合物的分子動力學(xué)模擬結(jié)果
            6.3.2.3 脂肪酶ROL與甘油單酯的對接
            6.3.2.4 酶與甘油單酯復(fù)合物的分子動力學(xué)模擬結(jié)果
    6.4 本章小結(jié)
第七章 總結(jié)與展望
    7.1 總結(jié)
    7.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性做優(yōu)化的脂肪酶ROL的基因序列
附錄Ⅱ 脂肪酶ROL完整的氨基酸序列
附錄Ⅲ 本論文所用的儀器設(shè)備列表
在學(xué)期間所取得的科研成果



本文編號：3956777