手性胺是指小分子化合物手性中心的取代基含有氨基的一類化合物,是多數(shù)醫(yī)藥、農(nóng)藥的重要中間體。例如,治療糖尿病的藥物西他列汀、抗生素青霉素及廣譜觸殺型除草劑草銨膦等都是手性胺化合物。轉(zhuǎn)氨酶制備手性胺的方法有兩種,分別為動力學(xué)拆分外消旋的胺及從前手性酮不對稱合成手性胺。其中不對稱合成制備手性胺的理論產(chǎn)率能夠達(dá)到100%,使轉(zhuǎn)氨酶在生產(chǎn)工業(yè)領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景。手性內(nèi)酰胺是抗生素中十分重要且具有廣泛生物活性的中間體。轉(zhuǎn)氨酶可催化醛酯或酮酯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,不對稱合成相應(yīng)的手性胺,隨后通過自發(fā)的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)獲得具有光學(xué)活性的手性內(nèi)酰胺中間體。由于目前催化這一反應(yīng)的轉(zhuǎn)氨酶種類較少,本論文對催化手性內(nèi)酰胺不對稱合成進(jìn)行了轉(zhuǎn)氨酶的基因挖掘,最終從數(shù)據(jù)庫中篩選到與模板酶相似度為29.4%來源枯草桿菌的假定轉(zhuǎn)氨酶yhxA(NCBI:CAB12754.2),氨基酸序列全長450 aa,與模板轉(zhuǎn)氨酶同屬乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族,隨后對yhxA進(jìn)行了可溶表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)yhxA的可溶表達(dá),選擇了利于蛋白NI-NTA親和層析純化的pET表達(dá)系統(tǒng)。但在pET-21a,pET-28a和pET-28b上未能獲得yhxA的可溶...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略語表
第一章 緒論
    1.1 轉(zhuǎn)氨酶
        1.1.1 轉(zhuǎn)氨酶簡介
        1.1.2 轉(zhuǎn)氨酶分類
        1.1.3 轉(zhuǎn)氨酶催化機(jī)制
        1.1.4 轉(zhuǎn)氨酶的底物特異性
        1.1.5 轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的類型
        1.1.6 轉(zhuǎn)氨酶的研究進(jìn)展
    1.2 基因挖掘
        1.2.1 基于功能的實(shí)驗分析
        1.2.2 由結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)功能
    1.3 酶的改造
        1.3.1 酶的定向進(jìn)化
        1.3.2 酶的理性設(shè)計
    1.4 本論文的研究思想
第二章 yhxA的可溶表達(dá)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗材料和儀器
        2.2.1 菌種與質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 引物設(shè)計
        2.2.4 溶液配制
        2.2.5 主要實(shí)驗儀器
    2.3 實(shí)驗方法
        2.3.1 yhxA基因挖掘
        2.3.2 yhxA基因克隆
        2.3.3 多聚氨基酸修飾yhxA的基因克隆
        2.3.4 yhxA重組菌的構(gòu)建
        2.3.5 多聚氨基酸修飾yhxA重組菌的構(gòu)建
        2.3.6 yhxA與多聚氨基酸修飾yhxA的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.7 多聚氨基酸修飾yhxA的純化
        2.3.8 多聚氨基酸修飾yhxA的活力測定
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 yhxA的基因挖掘與表達(dá)
        2.4.2 多聚氨基酸修飾yhxA的構(gòu)建與表達(dá)
        2.4.3 多聚氨基酸修飾yhxA表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.4.4 多聚氨基酸修飾yhxA的純化
        2.4.5 多聚氨基酸修飾yhxA的活力測定
    2.5 小結(jié)
第三章 yhxA催化性能的改造
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗材料和儀器
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 實(shí)驗儀器
        3.2.3 引物設(shè)計
    3.3 實(shí)驗方法
        3.3.1 yhxA的同源模建
        3.3.2 yhxA的分子對接
        3.3.3 多聚氨基酸修飾yhxA的飽和突變
        3.3.4 yhxA的飽和突變
        3.3.5 yhxA突變體催化活性
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 yhxA的同源模建
        3.4.2 yhxA的分子對接
        3.4.3 多聚氨基酸修飾yhxA的飽和突變
        3.4.4 yhxA的飽和突變
        3.4.5 yhxA突變體表達(dá)的優(yōu)化
    3.5 小結(jié)
第四章 yhxAs的酶學(xué)性質(zhì)及催化性能
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗儀器
    4.3 實(shí)驗方法
        4.3.1 最適溫度與熱穩(wěn)定性的測定
        4.3.2 最適pH與 pH穩(wěn)定性的測定
        4.3.3 金屬離子穩(wěn)定性的測定
        4.3.4 篩選yhxAs的底物范圍
        4.3.5 不對稱合成手性內(nèi)酰胺
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 yhxAs的最適溫度與熱穩(wěn)定性
        4.4.2 yhxAs的最適pH及 pH穩(wěn)定性
        4.4.3 yhxAs的金屬離子穩(wěn)定性
        4.4.4 yhxAs的底物范圍
        4.4.5 yhxAs催化手性內(nèi)酰胺不對稱合成
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號：3882944