發(fā)布時間：2023-11-26 15:55

　　乳酸菌具有優(yōu)良的益生功能,在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。然而在發(fā)酵生產(chǎn)、儲藏和消化吸收的過程中菌株會面臨嚴(yán)峻的酸脅迫,嚴(yán)重影響菌株的生長和益生功能的發(fā)揮,因此提高其酸脅迫抗性尤為迫切。前期研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)天冬氨酸的積累可有效增強菌株的酸脅迫抗性,但目前對其研究還相對較少,作用機制尚不清晰。因此,本論文以Lactococcus lactis NZ9000為研究對象,通過外源添加天冬氨酸(Asp)的方式驗證其作用效果,解析其作用機制;并分別過量表達天冬酰胺酶和酸性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白AcaP提高胞內(nèi)Asp的積累量,進而增強L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性。首先通過外源添加Asp的方式,證實了Asp的作用效果,在pH 6.0、5.5、5.0條件下,與對照組相比,實驗組L.lactis NZ9000生物量分別增加23.9%、63.3%和463.0%;pH 4.0條件下脅迫培養(yǎng)3.5 h,實驗組存活率為對照組的75.0倍。考查了脅迫條件下Asp對L.lactis NZ9000能量和氨基酸代謝途徑中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,發(fā)現(xiàn)實驗組糖酵解途徑中的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào);Glu代謝途徑中谷氨酸脫羧酶基...

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 概述
        1.1.1 乳酸菌簡介
        1.1.2 乳酸菌的應(yīng)用
        1.1.3 乳酸菌面臨的環(huán)境脅迫
    1.2 國內(nèi)外研究進展
        1.2.1 乳酸菌的酸脅迫應(yīng)對機制
        1.2.2 提高乳酸菌酸脅迫抗性的策略
    1.3 本論文立題依據(jù)和研究意義
    1.4 本論文主要研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
    2.2 驗證Asp提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        2.2.1 Asp最適添加濃度的測定
        2.2.2 Asp對L.lactis NZ9000生長性能影響的測定
        2.2.3 L.lactis NZ9000乳酸產(chǎn)量的測定
        2.2.4 L.lactis NZ9000酸脅迫抗性分析
    2.3 Asp作用機制解析
        2.3.1 熒光實時定量PCR
        2.3.2 L.lactis NZ9000胞內(nèi)氨基酸含量的測定
        2.3.3 L.lactis NZ9000胞內(nèi)微環(huán)境分析
    2.4 過量表達天冬酰胺酶提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        2.4.1 L.lactis NZ9000基因組的提取與ansB基因的擴增
        2.4.2 pNZ8148質(zhì)粒的提取
        2.4.3 L.lactis NZ9000感受態(tài)的制備
        2.4.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
        2.4.5 天冬酰胺酶的誘導(dǎo)表達、酶活力測定
        2.4.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB生長和產(chǎn)酸性能的測定
        2.4.7 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)氨基酸含量的測定
        2.4.8 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB存活率的測定
        2.4.9 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平
        2.4.10 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)微環(huán)境分析
    2.5 過量表達AcaP轉(zhuǎn)運蛋白提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        2.5.1 ylcA基因的擴增
        2.5.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
        2.5.3 AcaP蛋白的誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE分析
        2.5.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA存活率的測定
        2.5.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平
        2.5.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA胞內(nèi)微環(huán)境分析
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 Asp提高L.lactis NZ9000酸脅迫抗性
        3.1.1 Asp最適添加濃度的確定
        3.1.2 Asp對L.lactis NZ9000生長性能的影響
        3.1.3 Asp對L.lactis NZ9000乳酸產(chǎn)量的影響
        3.1.4 Asp對L.lactis NZ9000酸脅迫抗性的影響
    3.2 Asp作用機制解析
        3.2.1 Asp對L.lactis NZ9000關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.2.2 Asp對L.lactis NZ9000胞內(nèi)Glu和GABA含量的影響
        3.2.3 Asp對L.lactis NZ9000胞內(nèi)微環(huán)境的影響
    3.3 過量表達天冬酰胺酶提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        3.3.1 天冬酰胺酶的誘導(dǎo)表達和酶活測定
        3.3.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB生長性能和乳酸產(chǎn)量的測定
        3.3.3 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)Asp和Glu含量的測定
        3.3.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB存活率的測定
        3.3.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.3.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)ATP和氨基酸含量的測定
        3.3.7 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansBΔpH_i和胞內(nèi)NH4
+含量的測定
    3.4 過量表達AcaP轉(zhuǎn)運蛋白提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        3.4.1 AcaP蛋白的誘導(dǎo)表達和胞內(nèi)Asp含量的測定
        3.4.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA生長性能和乳酸產(chǎn)量的測定
        3.4.3 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA存活率的測定
        3.4.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.4.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA胞內(nèi)ATP和氨基酸含量的測定
        3.4.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcAΔpH_i和Δφ的測定
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和專利



本文編號：3868090

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