乳酸菌具有優(yōu)良的益生功能,在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。然而在發(fā)酵生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和消化吸收的過(guò)程中菌株會(huì)面臨嚴(yán)峻的酸脅迫,嚴(yán)重影響菌株的生長(zhǎng)和益生功能的發(fā)揮,因此提高其酸脅迫抗性尤為迫切。前期研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)天冬氨酸的積累可有效增強(qiáng)菌株的酸脅迫抗性,但目前對(duì)其研究還相對(duì)較少,作用機(jī)制尚不清晰。因此,本論文以Lactococcus lactis NZ9000為研究對(duì)象,通過(guò)外源添加天冬氨酸(Asp)的方式驗(yàn)證其作用效果,解析其作用機(jī)制;并分別過(guò)量表達(dá)天冬酰胺酶和酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcaP提高胞內(nèi)Asp的積累量,進(jìn)而增強(qiáng)L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性。首先通過(guò)外源添加Asp的方式,證實(shí)了Asp的作用效果,在pH 6.0、5.5、5.0條件下,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組L.lactis NZ9000生物量分別增加23.9%、63.3%和463.0%;pH 4.0條件下脅迫培養(yǎng)3.5 h,實(shí)驗(yàn)組存活率為對(duì)照組的75.0倍。考查了脅迫條件下Asp對(duì)L.lactis NZ9000能量和氨基酸代謝途徑中關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組糖酵解途徑中的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào);Glu代謝途徑中谷氨酸脫羧酶基...

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 概述
        1.1.1 乳酸菌簡(jiǎn)介
        1.1.2 乳酸菌的應(yīng)用
        1.1.3 乳酸菌面臨的環(huán)境脅迫
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.2.1 乳酸菌的酸脅迫應(yīng)對(duì)機(jī)制
        1.2.2 提高乳酸菌酸脅迫抗性的策略
    1.3 本論文立題依據(jù)和研究意義
    1.4 本論文主要研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
    2.2 驗(yàn)證Asp提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        2.2.1 Asp最適添加濃度的測(cè)定
        2.2.2 Asp對(duì)L.lactis NZ9000生長(zhǎng)性能影響的測(cè)定
        2.2.3 L.lactis NZ9000乳酸產(chǎn)量的測(cè)定
        2.2.4 L.lactis NZ9000酸脅迫抗性分析
    2.3 Asp作用機(jī)制解析
        2.3.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR
        2.3.2 L.lactis NZ9000胞內(nèi)氨基酸含量的測(cè)定
        2.3.3 L.lactis NZ9000胞內(nèi)微環(huán)境分析
    2.4 過(guò)量表達(dá)天冬酰胺酶提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        2.4.1 L.lactis NZ9000基因組的提取與ansB基因的擴(kuò)增
        2.4.2 pNZ8148質(zhì)粒的提取
        2.4.3 L.lactis NZ9000感受態(tài)的制備
        2.4.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
        2.4.5 天冬酰胺酶的誘導(dǎo)表達(dá)、酶活力測(cè)定
        2.4.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB生長(zhǎng)和產(chǎn)酸性能的測(cè)定
        2.4.7 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)氨基酸含量的測(cè)定
        2.4.8 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB存活率的測(cè)定
        2.4.9 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平
        2.4.10 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)微環(huán)境分析
    2.5 過(guò)量表達(dá)AcaP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        2.5.1 ylcA基因的擴(kuò)增
        2.5.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
        2.5.3 AcaP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析
        2.5.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA存活率的測(cè)定
        2.5.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平
        2.5.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA胞內(nèi)微環(huán)境分析
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 Asp提高L.lactis NZ9000酸脅迫抗性
        3.1.1 Asp最適添加濃度的確定
        3.1.2 Asp對(duì)L.lactis NZ9000生長(zhǎng)性能的影響
        3.1.3 Asp對(duì)L.lactis NZ9000乳酸產(chǎn)量的影響
        3.1.4 Asp對(duì)L.lactis NZ9000酸脅迫抗性的影響
    3.2 Asp作用機(jī)制解析
        3.2.1 Asp對(duì)L.lactis NZ9000關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.2.2 Asp對(duì)L.lactis NZ9000胞內(nèi)Glu和GABA含量的影響
        3.2.3 Asp對(duì)L.lactis NZ9000胞內(nèi)微環(huán)境的影響
    3.3 過(guò)量表達(dá)天冬酰胺酶提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        3.3.1 天冬酰胺酶的誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定
        3.3.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB生長(zhǎng)性能和乳酸產(chǎn)量的測(cè)定
        3.3.3 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)Asp和Glu含量的測(cè)定
        3.3.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB存活率的測(cè)定
        3.3.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.3.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞內(nèi)ATP和氨基酸含量的測(cè)定
        3.3.7 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansBΔpH_i和胞內(nèi)NH4
+含量的測(cè)定
    3.4 過(guò)量表達(dá)AcaP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高L.lactis NZ9000的酸脅迫抗性
        3.4.1 AcaP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和胞內(nèi)Asp含量的測(cè)定
        3.4.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA生長(zhǎng)性能和乳酸產(chǎn)量的測(cè)定
        3.4.3 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA存活率的測(cè)定
        3.4.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.4.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA胞內(nèi)ATP和氨基酸含量的測(cè)定
        3.4.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcAΔpH_i和Δφ的測(cè)定
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和專利



本文編號(hào)：3868090

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