煙草花葉病毒(TMV)是一種寄主眾多、傳染性強和抗逆性強的植物病毒,至今尚未有一種方法能對TMV進行根除。綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥是抑制病毒的方法之一。Flammutoxin(FTX)與其僅相差20個氨基酸的前體物質(zhì)TEER-decreasing protein(TDP)是僅僅產(chǎn)生于金針菇子實體發(fā)育與生長階段的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),FTX或TDP具有抗TMV特性,但目前還沒確認在抗TMV過程中到底是哪種蛋白發(fā)揮作用或主要作用。為了確認不同蛋白的抗TMV效果及分析可能的抗病機制,本實驗利用大腸桿菌表達體系,成功構(gòu)建了 FTX和TDP的原核表達重組質(zhì)粒,隨后通過誘導表達獲得TDP-pET32a和FTX-pET32a重組蛋白并利用固定化金屬離子親和層析(IMAC)進行純化。結(jié)果顯示,采用1mM濃度的誘導劑IPTG,于37℃誘導8h蛋白可以得到較多的蛋白,且pET32a標簽蛋白、重組蛋白 FTX-pET32a 和 TDP-pET32a 在 250mM、200mM 和 250mM Elution buffer洗脫下能獲得更多的純化蛋白。以K326普通煙草為研究對象,從蛋白的保護作用和治療作用兩個方面研究了...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞
第1章 前言
    1.1 TMV的危害
    1.2 TMV的防治
        1.2.1 農(nóng)業(yè)防治
        1.2.2 化學防治
        1.2.3 生物防治
    1.3 生物農(nóng)藥抗TMV的機制研究
        1.3.1 對TMV的鈍化作用
        1.3.2 對寄主的保護作用
        1.3.3 對寄主的治療作用
    1.4 FTX和TDP蛋白的研究進展
    1.5 研究內(nèi)容與意義
        1.5.1 研究內(nèi)容
        1.5.2 研究意義
第2章 FTX和TDP的原核表達體系的構(gòu)建
    2.1 試驗材料
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 pET32a載體圖譜
        2.1.3 主要藥劑及試劑盒
        2.1.4 主要儀器與設(shè)備
        2.1.5 主要試劑和培養(yǎng)基的配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 FTX和TDP基因引物的設(shè)計
        2.2.2 金針菇的總RNA提取
        2.2.3 RT-PCR擴增FTX和TDP基因cDNA序列
        2.2.4 重組載體FTX-pET32a和TDP-pET32a的構(gòu)建
        2.2.5 重組質(zhì)粒FTX-pET32a和TDP-pET32a轉(zhuǎn)入表達菌株
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 FTX和TDP蛋白cDNA的RT-PCR結(jié)果
        2.3.2 重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定
        2.3.3 FTX和TDP蛋白cDNA序列測定結(jié)果
    2.4 本章小結(jié)與討論
第3章 重組蛋白的誘導表達與純化
    3.1 試驗材料
        3.1.1 主要試劑及試劑盒
        3.1.2 主要儀器與設(shè)備
        3.1.3 主要試劑的配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 各重組蛋白的誘導表達條件優(yōu)化
        3.2.2 重組蛋白的誘導表達及純化
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 誘導表達最適溫度的確定
        3.3.2 SDS-PAGE和Western blot分析蛋白FTX和TDP
        3.3.3 FTX和TDP蛋白的純化結(jié)果
        3.3.4 重組蛋白濃度測定
    3.4 本章小結(jié)與討論
第4章 FTX和TDP對感染TMV煙草的保護作用
    4.1 試驗材料、試劑和儀器
        4.1.1 試劑材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 儀器與設(shè)備
    4.2 試驗方法
        4.2.1 TMV的提純
        4.2.2 摩擦接種煙草花葉病毒
        4.2.3 各蛋白誘導作用試驗處理
        4.2.4 防御酶酶活性的測定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 各試驗組煙草癥狀圖
        4.3.2 過氧化物酶活性變化
        4.3.3 多酚氧化酶活性變化
        4.3.4 幾丁質(zhì)酶活性變化
        4.3.5 苯丙氨酸解氨酶活性變化
    4.4 本章小結(jié)與討論
第5章 實時熒光定量PCR檢測各蛋白對TMV的治療作用
    5.1 試驗材料
        5.1.1 主要試劑及試劑盒
        5.1.2 主要試劑及試劑盒
        5.1.3 主要儀器與設(shè)備
    5.2 試驗方法
        5.2.1 各蛋白誘導作用試驗處理
        5.2.2 引物設(shè)計
        5.2.3 普通RT-PCR擴增檢測引物的特異性
        5.2.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)分析TMV含量
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 普通RT-PCR擴增檢測引物的特異性
        5.3.2 qRT-PCR動力學溶解曲線
        5.3.3 FTX和TDP處理后煙草中TMV基因表達量的變化
    5.4 本章小結(jié)與討論
第6章 結(jié)論與展望
致謝
參考文獻



本文編號：3867491