低聚龍膽糖是一種具有益生功能的新型功能性低聚糖,其含有的β-1,6葡萄糖苷鍵不易被人體消化降解,有利于雙歧桿菌和乳桿菌等腸道微生物的生長。目前只有日本能夠大規(guī)模生產(chǎn)低聚龍膽糖,我國仍處于起步階段。一種性能良好的β-葡萄糖苷酶對于生產(chǎn)低聚龍膽糖至關(guān)重要。本研究在枯草芽孢桿菌中成功重組表達β-葡萄糖苷酶基因TsBgl1A,對其表達的β-葡萄糖苷酶TsBgl1A生產(chǎn)低聚龍膽糖的條件進行了優(yōu)化。之后通過定點突變獲得三個轉(zhuǎn)化率提高的突變體,結(jié)合突變位點的三維空間位置從轉(zhuǎn)苷/水解比、動力學參數(shù)等方面分析了突變體轉(zhuǎn)化率提高的原因,最后對最優(yōu)突變體G224A進行了搖瓶優(yōu)化和3-L罐發(fā)酵條件的初步摸索。主要研究結(jié)果如下:(1)熱袍菌Thermotoga sp.KOL6來源的β-葡萄糖苷酶基因TsBgl1A成功在B.subtilis WS11中重組表達。進一步對重組酶的酶學性質(zhì)進行探究,測得其最適溫度和最適pH分別為90℃和6.0,重組酶具有良好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性;重組酶對四種二糖底物和pNPG具有良好的水解活力。(2)分別探究了不同條件對重組酶制備低聚龍膽糖的影響,確定最優(yōu)酶轉(zhuǎn)化條件:反應(yīng)溫度80...

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 β-葡萄糖苷酶簡介
        1.1.1 β-葡萄糖苷酶的來源及催化機制
        1.1.2 β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性
    1.2 低聚龍膽糖簡述
        1.2.1 低聚龍膽糖的理化性質(zhì)
        1.2.2 低聚龍膽糖的制備方法及研究現(xiàn)狀
        1.2.3 低聚龍膽糖的應(yīng)用前景
    1.3 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)
    1.4 立題依據(jù)及意義
    1.5 本論文的研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實驗儀器
    2.2 培養(yǎng)條件
        2.2.1 培養(yǎng)基
        2.2.2 培養(yǎng)條件
    2.3 基因工程操作方法
        2.3.1 引物設(shè)計
        2.3.2 核酸膠電泳驗證和回收
        2.3.3 枯草芽孢桿菌表達載體的構(gòu)建
        2.3.4 突變質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.5 大腸桿菌JM109菌株感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化
        2.3.6 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
    2.4 分析方法
        2.4.1 菌體濃度的測定
        2.4.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.4.3 β-葡萄糖苷酶酶活測定
        2.4.4 葡萄糖濃度測定
        2.4.5 蛋白濃度測定
        2.4.6 純化方法
        2.4.7 轉(zhuǎn)苷/水解測定
        2.4.9 低聚龍膽糖的酶轉(zhuǎn)化工藝及檢測
        2.4.10 分子模擬
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 β-葡萄糖苷酶在枯草芽孢桿菌中的重組表達及酶學性質(zhì)研究
        3.1.1 重組菌B.subtilis/p BSMμL3-Tsbgl1A的構(gòu)建
        3.1.2 重組酶Ts Bgl1A的表達與純化
        3.1.3 重組酶Ts Bgl1A的酶學性質(zhì)
    3.2 β-葡萄糖苷酶制備低聚龍膽糖的條件優(yōu)化
        3.2.1 反應(yīng)時間對制備低聚龍膽糖的影響
        3.2.2 加酶量對制備低聚龍膽糖的影響
        3.2.3 溫度對制備低聚龍膽糖的影響
        3.2.4 pH對制備低聚龍膽糖的影響
        3.2.5 葡萄糖濃度對低聚龍膽糖轉(zhuǎn)化率的影響
    3.3 β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性分子改造
        3.3.1 突變體的設(shè)計及構(gòu)建
        3.3.2 突變體制備低聚龍膽糖轉(zhuǎn)化率
        3.3.3 突變體對重組酶Ts Bgl1A轉(zhuǎn)苷活性影響的機制分析
    3.4 重組菌B.subtilis/p BSMμL3-Ts Bgl1A-G224A的發(fā)酵條件優(yōu)化
        3.4.1 重組菌的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化
        3.4.2 重組菌的3-L罐發(fā)酵
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3864251