生物丁醇作為石油替代品,具有能量密度高、揮發(fā)性低、腐蝕性弱等物理特性。拜氏梭菌是用于生物法生產丁醇的極具潛力的工業(yè)菌株,但是利用拜氏梭菌生產丁醇也存在一些缺陷,如丁醇產量低,發(fā)酵副產物丙酮比例較高,木糖利用效率低,以及適用于拜氏梭菌的基因編輯技術有限等。因此,本論文主要針對以上問題進行了探究。參與調控因子Spo0A磷酸化的組氨酸激酶在一些產溶劑梭菌,例如丙酮丁醇梭菌中可以調控溶劑合成和孢子分化,而在拜氏梭菌中還沒有相關研究。通過同源比對,篩選出6個與丙酮丁醇梭菌組氨酸激酶同源序列超過30%的候選基因,包括cbei2073,cbei4484,cbei2087,cbei2435,cbei4925和cbei1553。采用CRISPR-Cas9n基因編輯技術對上述基因進行刪除。敲除基因cbei2073和cbei4484使丁醇產量發(fā)生顯著性的變化,丁醇濃度分別從9.8 g/L提高到13.8 g/L和11.5 g/L,分別提高了40.8%和17.3%。而且,兩株突變菌的丁醇合成速度更快,丁醇生產強度相對于野生菌株分別提高了40.0%和20.0%,證明這兩個組氨酸激酶在拜氏梭菌中對胞內的產物合成代謝...

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻綜述
    1.1 生物能源的現(xiàn)狀
    1.2 丁醇概述
        1.2.1 丁醇的性質和用途
        1.2.2 丁醇的生物生產方法
        1.2.3 ABE發(fā)酵目前面臨的挑戰(zhàn)
    1.3 CRISPR-Cas技術簡介
        1.3.1 CRISPR-Cas技術的發(fā)展歷史
        1.3.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)功能及分類
        1.3.3 CRISPR-Cas9 技術在細菌基因編輯中的應用
    1.4 組氨酸激酶對梭菌的調控作用
    1.5 課題主要意義及主要研究內容
2 組氨酸激酶對拜氏梭菌的調控
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株及質粒
        2.2.2 主要實驗儀器
        2.2.3 主要實驗試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 培養(yǎng)基的配制
        2.3.2 選擇及預測孤立的組氨酸激酶編碼基因
        2.3.3 PAM序列的選擇及重組質粒的構建
        2.3.4 電轉化及陽性轉化子的驗證保菌
        2.3.5 ABE發(fā)酵驗證
        2.3.6 孢子數(shù)量
    2.4 結果與討論
        2.4.1 質粒構建結果及電轉化結果
        2.4.2 組氨酸激酶失活對溶劑合成的影響
        2.4.3 組氨酸激酶失活對孢子數(shù)量的影響
    2.5 本章小結
3 乙酰乙酸脫羧酶編碼基因adc對拜氏梭菌的影響
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌株及質粒
        3.2.2 主要實驗儀器
        3.2.3 主要實驗試劑
    3.3 實驗方法
        3.3.1 培養(yǎng)基配制
        3.3.2 菌株Δcbei3835和Δcbei2073/3835 的構建
        3.3.3 酸重吸收基因的過表達
        3.3.4 基因cbei3835(adc)的抑制表達
    3.4 結果與討論
        3.4.1 菌株構建結果
        3.4.2 敲除adc基因對發(fā)酵產物的影響
        3.4.3 強化酸重吸收途徑對發(fā)酵產物的影響
        3.4.4 添加甲基紫精對發(fā)酵產物的影響
        3.4.5 抑制adc基因表達對發(fā)酵產物的影響
    3.5 本章小結
4 拜氏梭菌利用木糖產丁醇能力的系統(tǒng)改造
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌株及質粒
        4.2.2 主要實驗儀器和實驗試劑
    4.3 實驗方法
        4.3.1 培養(yǎng)基配制
        4.3.2 重組質粒的構建
        4.3.3 電轉化及驗證、保菌
        4.3.4 ABE發(fā)酵驗證
    4.4 結果與討論
        4.4.1 菌株構建結果
        4.4.2 ABE發(fā)酵驗證結果
    4.5 本章小結
結論
展望
創(chuàng)新點
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況
致謝



本文編號：3795316