乳清酸又稱維生素B13,在生理上具有十分關(guān)鍵的作用,可應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)品、化妝品等領(lǐng)域。乳清酸通過化學(xué)法合成的成本高、污染大,而利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳清酸是一種綠色環(huán)保的替代方法。本研究通過代謝工程的策略與技術(shù)對大腸桿菌BW25113野生型菌株的乳清酸合成途徑進行優(yōu)化,首先通過在關(guān)鍵酶基因前整合T7啟動子、轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒以及提高前體供應(yīng)水平的策略增強途徑的通量,使乳清酸產(chǎn)量達到了 82.90mg/L。為了避免乳清酸在DNA復(fù)制的過程中被大量消耗,對乳清酸下游的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因pyrE進行敲除,得到乳清酸積累菌株BW-OR13,乳清酸產(chǎn)量大幅提高至1011.70 mg/L。在此基礎(chǔ)上,分別敲除基因argF和dctA,以敲除旁路代謝及修飾乳清酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng),結(jié)果并不理想。通過轉(zhuǎn)化表達磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒對尿嘧啶進行回補,雖改善了菌株生長,卻使乳清酸產(chǎn)量發(fā)生下降。進一步對菌株BW-OR13進行模塊優(yōu)化,最高可得到的乳清酸產(chǎn)量為1126.39 mg/L。進一步改善副產(chǎn)物乙酸的積累情況,對培養(yǎng)基進行優(yōu)化,使乳清酸產(chǎn)量提高至2185.23 mg/L。通過敲除基因iclR和arcA激活乙醛酸循環(huán),使發(fā)酵...

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集
摘要
Abstract
英文名詞縮寫表
第一章 緒論
    1.1 乳清酸
        1.1.1 理化性質(zhì)
        1.1.2 應(yīng)用
    1.2 乳清酸的合成方法
        1.2.1 乳清酸化學(xué)合成
        1.2.2 乳清酸生物合成
    1.3 大腸桿菌乳清酸合成
        1.3.1 嘧啶核苷合成途徑
        1.3.2 乳清酸合成關(guān)鍵酶
        1.3.3 乳清酸合成前體
        1.3.4 乳清酸分解代謝
        1.3.5 乳清酸合成旁路代謝
        1.3.6 乳清酸轉(zhuǎn)運蛋白
        1.3.7 TCA循環(huán)與乙醛酸循環(huán)的影響
        1.3.8 糖酵解途徑的影響
    1.4 RED同源重組技術(shù)
    1.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 引物、質(zhì)粒、菌株
        2.1.2 實驗儀器、試劑、培養(yǎng)基
    2.2 實驗方法
        2.2.1 引物設(shè)計
        2.2.2 PCR
        2.2.3 質(zhì)粒提取
        2.2.4 酶切與連接
        2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.6 DNA回收
        2.2.7 轉(zhuǎn)化
        2.2.8 轉(zhuǎn)化子篩選
        2.2.9 RED基因重組技術(shù)
        2.2.10 CRISPR基因編輯技術(shù)
        2.2.11 發(fā)酵
        2.2.12 樣品分析
第三章 乳清酸內(nèi)源合成途徑的增強
    3.1 T7啟動子的整合
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗方法
        3.1.3 實驗結(jié)果與討論
    3.2 模塊優(yōu)化
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗方法
        3.2.3 實驗結(jié)果與討論
    3.3 前體供應(yīng)水平的提高
        3.3.1 實驗材料
        3.3.2 實驗方法
        3.3.3 實驗結(jié)果與討論
    3.4 本章小結(jié)
第四章 乳清酸積累菌株的構(gòu)建及篩選
    4.1 乳清酸合成下游基因的敲除
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 實驗方法
        4.1.3 實驗結(jié)果與討論
    4.2 精氨酸合成相關(guān)基因的敲除
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗方法
        4.2.3 實驗結(jié)果與討論
    4.3 乳清酸轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的敲除
        4.3.1 實驗材料
        4.3.2 實驗方法
        4.3.3 實驗結(jié)果與討論
    4.4 生長狀況的改善
        4.4.1 實驗材料
        4.4.2 實驗方法
        4.4.3 實驗結(jié)果與討論
    4.5 模塊優(yōu)化
        4.5.1 實驗材料
        4.5.2 實驗方法
        4.5.3 實驗結(jié)果與討論
    4.6 本章小結(jié)
第五章 副產(chǎn)物乙酸的減少
    5.1 培養(yǎng)基優(yōu)化
        5.1.1 實驗材料
        5.1.2 實驗方法
        5.1.3 實驗結(jié)果與討論
    5.2 乙醛酸循環(huán)的激活
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 實驗方法
        5.2.3 實驗結(jié)果與討論
    5.3 糖酵解途徑弱化
        5.3.1 實驗材料
        5.3.2 實驗方法
        5.3.3 實驗結(jié)果與討論
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
附錄
致謝
作者和導(dǎo)師簡介
附件



本文編號：3792200