寶丹酮是一種重要的蛋白同化雄性激素類固醇,可以穩(wěn)定、持續(xù)地增長(zhǎng)肌肉和力量,現(xiàn)在主要由1,4-雄烯二酮(1,4-Androstenedione,ADD)通過(guò)化學(xué)法合成。生物轉(zhuǎn)化法與化學(xué)合成寶丹酮相比,具有轉(zhuǎn)化條件溫和,環(huán)境污染小,副產(chǎn)物少等優(yōu)勢(shì)。但由于合成寶丹酮的17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)很少被鑒定或者已被鑒定的17β-HSD不具有催化17β-還原反應(yīng)的活性,導(dǎo)致了對(duì)酶的利用率較低,因此需要篩選具有更高活性的17β-羥基類固醇脫氫酶。本論文對(duì)多種不同來(lái)源的17β-HSD進(jìn)行了分析和篩選,獲得了具有較高17β-還原活性的重組酶HSDBo,在高效積累甾體藥物中間體(ADD)的宿主中表達(dá),以及構(gòu)建了輔酶自循環(huán)體系,實(shí)現(xiàn)了從簡(jiǎn)單易得的原料植物甾醇到甾體激素藥物寶丹酮的一步轉(zhuǎn)化。(1)本研究首先對(duì)17β-羥基類固醇脫氫酶基因進(jìn)行了篩選,根據(jù)其氨基酸序列,進(jìn)行了同源性分析和序列比對(duì)。分別選取了來(lái)源于真菌和細(xì)菌的7種不同17β-HSD,在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)重組蛋白均可成功表達(dá)。進(jìn)一步考察了各個(gè)重組17β-HSD對(duì)底物ADD的轉(zhuǎn)化情況。發(fā)現(xiàn)重組酶HSD...

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 甾類化合物
        1.1.1 甾類化合物概述
        1.1.2 甾類物質(zhì)的藥用價(jià)值
    1.2 甾體化合物的生化合成
        1.2.1 甾體化合物合成的發(fā)展
        1.2.2 微生物轉(zhuǎn)化法合成甾體化合物
        1.2.3 代謝甾體化合物的微生物
        1.2.4 甾體藥物寶丹酮的合成
    1.3 17β-羥基類固醇脫氫酶
        1.3.1 甾醇17β-羥基化反應(yīng)概況
        1.3.2 17β-羥基類固醇脫氫酶在甾體藥物合成中的應(yīng)用
    1.4 輔酶NADPH再生體系的構(gòu)建
        1.4.1 輔酶NADPH再生的概述
        1.4.2 輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建
    1.5 論文研究?jī)?nèi)容
        1.5.1 論文的立題背景及研究意義
        1.5.2 論文主要研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 引物設(shè)計(jì)
        2.1.3 常用試劑及其配置
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        2.2.2 新金色分枝桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        2.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 17β-HSD在大腸桿菌中的表達(dá)和純化
        2.2.5 HSDBo和 G6PDH酶活性測(cè)定和部分酶學(xué)性質(zhì)分析
        2.2.6 胞內(nèi)輔酶NADPH/NADP+水平測(cè)定
        2.2.7 重組M.neoaurum JC-12 對(duì)植物甾醇的轉(zhuǎn)化
        2.2.8 5-L發(fā)酵罐中M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇生成寶丹酮的放大研究
        2.2.9 分析方法
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 17β-羥基類固醇脫氫酶的篩選
        3.1.1 各17β-HSD的氨基酸序列同源性分析
        3.1.2 重組菌BL21/p ET28a-HSD的構(gòu)建
        3.1.3 17β-羥基類固醇脫氫酶的異源表達(dá)及SDS-PAGE分析
        3.1.4 各個(gè)重組酶對(duì)ADD的轉(zhuǎn)化能力評(píng)估
    3.2 17β-HSD的酶學(xué)性質(zhì)分析及其輔酶的研究
        3.2.1 重組酶HSDBo的純化
        3.2.2 重組酶HSDBo最適p H和最適溫度的測(cè)定
        3.2.3 金屬離子對(duì)重組酶HSDBo活性的影響
        3.2.4 HSDBo的輔酶依賴性鑒定
    3.3 輔酶再生體系的構(gòu)建
        3.3.1 重組M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-GDHMn的構(gòu)建
        3.3.2 輔酶循環(huán)體系對(duì)重組新金色分枝桿菌合成寶丹酮及NADPH、NADP+含量的影響
    3.4 優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件提高寶丹酮的產(chǎn)量
        3.4.1 助溶劑對(duì)重組菌發(fā)酵合成寶丹酮的影響
        3.4.2 植物甾醇濃度對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)寶丹酮的影響
        3.4.3 葡萄糖對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)寶丹酮的影響
        3.4.4 重組菌M.neoaurum JC-12/pMV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇的生成寶丹酮的放大研究
主要結(jié)論及展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3766125