發(fā)布時間：2023-03-19 22:38

　　寶丹酮是一種重要的蛋白同化雄性激素類固醇,可以穩(wěn)定、持續(xù)地增長肌肉和力量,現(xiàn)在主要由1,4-雄烯二酮(1,4-Androstenedione,ADD)通過化學法合成。生物轉化法與化學合成寶丹酮相比,具有轉化條件溫和,環(huán)境污染小,副產物少等優(yōu)勢。但由于合成寶丹酮的17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)很少被鑒定或者已被鑒定的17β-HSD不具有催化17β-還原反應的活性,導致了對酶的利用率較低,因此需要篩選具有更高活性的17β-羥基類固醇脫氫酶。本論文對多種不同來源的17β-HSD進行了分析和篩選,獲得了具有較高17β-還原活性的重組酶HSDBo,在高效積累甾體藥物中間體(ADD)的宿主中表達,以及構建了輔酶自循環(huán)體系,實現(xiàn)了從簡單易得的原料植物甾醇到甾體激素藥物寶丹酮的一步轉化。(1)本研究首先對17β-羥基類固醇脫氫酶基因進行了篩選,根據(jù)其氨基酸序列,進行了同源性分析和序列比對。分別選取了來源于真菌和細菌的7種不同17β-HSD,在大腸桿菌中進行了異源表達。經SDS-PAGE驗證,發(fā)現(xiàn)重組蛋白均可成功表達。進一步考察了各個重組17β-HSD對底物ADD的轉化情況。發(fā)現(xiàn)重組酶HSD...

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 甾類化合物
        1.1.1 甾類化合物概述
        1.1.2 甾類物質的藥用價值
    1.2 甾體化合物的生化合成
        1.2.1 甾體化合物合成的發(fā)展
        1.2.2 微生物轉化法合成甾體化合物
        1.2.3 代謝甾體化合物的微生物
        1.2.4 甾體藥物寶丹酮的合成
    1.3 17β-羥基類固醇脫氫酶
        1.3.1 甾醇17β-羥基化反應概況
        1.3.2 17β-羥基類固醇脫氫酶在甾體藥物合成中的應用
    1.4 輔酶NADPH再生體系的構建
        1.4.1 輔酶NADPH再生的概述
        1.4.2 輔酶再生系統(tǒng)的構建
    1.5 論文研究內容
        1.5.1 論文的立題背景及研究意義
        1.5.2 論文主要研究內容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株及質粒
        2.1.2 引物設計
        2.1.3 常用試劑及其配置
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉化
        2.2.2 新金色分枝桿菌感受態(tài)的制備與轉化
        2.2.3 重組質粒的構建
        2.2.4 17β-HSD在大腸桿菌中的表達和純化
        2.2.5 HSDBo和 G6PDH酶活性測定和部分酶學性質分析
        2.2.6 胞內輔酶NADPH/NADP+水平測定
        2.2.7 重組M.neoaurum JC-12 對植物甾醇的轉化
        2.2.8 5-L發(fā)酵罐中M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇生成寶丹酮的放大研究
        2.2.9 分析方法
第三章 結果與討論
    3.1 17β-羥基類固醇脫氫酶的篩選
        3.1.1 各17β-HSD的氨基酸序列同源性分析
        3.1.2 重組菌BL21/p ET28a-HSD的構建
        3.1.3 17β-羥基類固醇脫氫酶的異源表達及SDS-PAGE分析
        3.1.4 各個重組酶對ADD的轉化能力評估
    3.2 17β-HSD的酶學性質分析及其輔酶的研究
        3.2.1 重組酶HSDBo的純化
        3.2.2 重組酶HSDBo最適p H和最適溫度的測定
        3.2.3 金屬離子對重組酶HSDBo活性的影響
        3.2.4 HSDBo的輔酶依賴性鑒定
    3.3 輔酶再生體系的構建
        3.3.1 重組M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-GDHMn的構建
        3.3.2 輔酶循環(huán)體系對重組新金色分枝桿菌合成寶丹酮及NADPH、NADP+含量的影響
    3.4 優(yōu)化轉化條件提高寶丹酮的產量
        3.4.1 助溶劑對重組菌發(fā)酵合成寶丹酮的影響
        3.4.2 植物甾醇濃度對重組菌發(fā)酵生產寶丹酮的影響
        3.4.3 葡萄糖對重組菌發(fā)酵生產寶丹酮的影響
        3.4.4 重組菌M.neoaurum JC-12/pMV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇的生成寶丹酮的放大研究
主要結論及展望
    主要結論
    展望
致謝
參考文獻
附錄:作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3766125