隨著生物柴油制造業(yè)的持續(xù)發(fā)展,其副產(chǎn)物甘油的量也大幅度的增加,如何利用甘油生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品成為研究的熱點(diǎn)。L-絲氨酸屬于非必需氨基酸,在醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。如果將過剩的甘油轉(zhuǎn)化成市場需求量大的L-絲氨酸,將會(huì)實(shí)現(xiàn)資源充分利用,且在一定程度上降低L-絲氨酸的生產(chǎn)成本。本論文以野生型大腸桿菌W3110為研究對(duì)象,對(duì)其L-絲氨酸合成途徑、降解途徑、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以及甘油利用途徑進(jìn)行改造,構(gòu)建了一株以甘油為底物,發(fā)酵產(chǎn)L-絲氨酸的重組大腸桿菌,并對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化,提高了重組大腸桿菌的發(fā)酵性能。論文的主要研究結(jié)果如下:（1）L-絲氨酸是細(xì)胞的初級(jí)代謝產(chǎn)物,經(jīng)L-絲氨酸脫氨酶（L-ser DH）催化生成丙酮酸。通過依次敲除tdcG、sdaA、sdaB,得到重組菌GAA,L-絲氨酸積累量為0.06 g/L,但菌株的生長有所下降,OD600最大值為8.1,較野生型大腸桿菌W3110下降了12.9%,重組菌在甘油利用方面沒有顯著變化,發(fā)酵18 h,甘油消耗完全。（2）3-磷酸甘油酸脫氫酶（PGDH）是L-絲氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶也是限速酶,受到L-絲氨酸的反饋抑制作用。定點(diǎn)突變PGD... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

大腸桿菌中L-絲氨酸代謝途徑

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文脫氫酶點(diǎn)突變對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵性能的影響。（3）提高菌株甘油利用速率，依次提高培養(yǎng)基中甘油的濃度，連續(xù)傳代培養(yǎng)，考察適應(yīng)性進(jìn)化對(duì)菌株利用甘油的影響。（4）提高重組菌絲氨酸的耐受濃度，通過過表達(dá)半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 eamA或者敲除相關(guān)基因 ROORM（ompX, opgE, rhtA, rybA and mntS），考察在不同濃度 L-絲氨酸中出發(fā)菌和重組菌的生長情況。L-絲氨酸脫氨酶失活后，大腸桿菌胞內(nèi) L-絲氨酸的降解將受阻，過量積累的 L-絲氨酸對(duì)菌株的生長有一定的抑制作用[21]。因此，通過過表達(dá)具有 L-絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 eamA 或者敲除 ROORM 基因（這些基因編碼的蛋白與細(xì)胞膜的滲透性或者是支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)），考察其對(duì)重組菌株耐受 L-絲氨酸的影響。（5）重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，確定菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分的最優(yōu)組合，提高重組菌株的 L-絲氨酸產(chǎn)量，在發(fā)酵罐上，研究重組菌的發(fā)酵工藝，提高菌株的發(fā)酵性能。

提取重組質(zhì)粒。.15 大腸桿菌基因敲除的方法采用 λRed 敲除系統(tǒng)[43]實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除以及 3-磷酸甘油酸脫氫酶（編碼A）三個(gè)位點(diǎn)突變。以同源臂較短的基因敲除為例，具體的操作步驟如圖 2-1 所 1，2 表示擴(kuò)增待敲除基因兩側(cè)的同源臂的引物，3，4 表示用于敲除驗(yàn)證的引（1）首先制備用于基因敲除的打靶片段，靶片段主要包括待敲除基因兩側(cè)同源T 位點(diǎn)、抗生素篩選標(biāo)記三個(gè)部分；（2）將質(zhì)粒 pKD46 轉(zhuǎn)入宿主中，并制備用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞；（3）將靶片段轉(zhuǎn)化到含有質(zhì)粒 pKD46 感受態(tài)細(xì)胞中并加入 L-阿拉伯糖的充分D46 表達(dá)重組酶（Exo、Beta、Gam），促進(jìn)靶片段中抗性篩選標(biāo)記整合到染色體實(shí)現(xiàn)目的基因敲除；（4）將替換成功的重組菌株在平板上高溫連續(xù)傳代，消除菌株內(nèi)部溫度敏感pKD46，以不含有 pKD46 的菌株再次制備成化轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入能表達(dá) flp 重度敏感型質(zhì)粒 pCP20，消除重組菌中抗生素篩選標(biāo)記。再次經(jīng)平板高溫傳代，內(nèi)部質(zhì)粒 pCP20，便于后續(xù)敲除其它基因。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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