葎草酮是啤酒花中的一種天然苦味酸,具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理活性,一般由提取法制備。隨著合成生物學(xué)和生物工程技術(shù)的不斷進(jìn)步,應(yīng)用工程菌通過發(fā)酵法制備天然活性化合物成為一種研究趨勢(shì),本研究在工程菌中構(gòu)建了葎草酮的全生物合成代謝途徑并研究了發(fā)酵、提取與分析方法。本研究首先從實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌菌株Trc-low出發(fā),將源于啤酒花的完整的葎草酮合成途徑整合到到出發(fā)菌株中,構(gòu)建了具備葎草酮全合成代謝途徑的工程菌并進(jìn)行了發(fā)酵驗(yàn)證。而后本研究利用高效液相色譜和核磁方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析,結(jié)果確證構(gòu)建的工程菌可以在胞內(nèi)合成葎草酮。本研究在產(chǎn)葎草酮菌株構(gòu)建過程中表達(dá)的六個(gè)異源酶分別是異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶（IDI）,異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶-1（PT1）,以及羧基輔酶A連接酶（CCL2）,戊-苯酮合酶（VPS）,異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶-2（PT2）和葎草酮合酶（monooxygenase）。這六個(gè)酶的對(duì)應(yīng)基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后重組到兩個(gè)表達(dá)載體中用于工程菌的轉(zhuǎn)化。在完成菌株的構(gòu)建,發(fā)酵和產(chǎn)物驗(yàn)證后,本研究進(jìn)一步對(duì)工程菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,研究了甲羥戊酸添加方式,接種量,誘導(dǎo)劑添加水平對(duì)工程菌株發(fā)酵產(chǎn)葎... 

【文章來源】：青島科技大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

啤酒花中葎草酮合成完整過程

天然產(chǎn)物葎草酮的全生物合成16草酮的合成可以更好的研究其獨(dú)特的藥用作用，并單獨(dú)用作藥物，以避免其它物質(zhì)的干擾，且為其它苦味酸提供生物合成的依據(jù)，六種苦味酸化合物具有類似的合成途徑和催化酶，同時(shí)葎草酮的合成也可為其它天然產(chǎn)物的合成提供示例，以為生物合成天然產(chǎn)物數(shù)量群的壯大貢獻(xiàn)一份力量�；蛟S葎草酮的生物合成還能用作它途，如與其它化合物的生物合成途徑結(jié)合，以生產(chǎn)合成出具有靶標(biāo)針對(duì)性的，藥物作用更為強(qiáng)大和治療更為精確的藥物。1.3.2本課題研究方案本課題以實(shí)驗(yàn)室保存的含部分甲羥戊酸（MVA）下游途徑的大腸桿菌Trc-low為出發(fā)菌株，設(shè)計(jì)并合成所需基因，再利用基因重組技術(shù)，將葎草酮的天然代謝途徑引入Trc-low菌株中，構(gòu)建出生產(chǎn)葎草酮的工程菌株，通過發(fā)酵技術(shù)表達(dá)合成出葎草酮產(chǎn)物，完整的課題研究技術(shù)路線如圖1-2所示。（1）以實(shí)驗(yàn)室保存的含部分甲羥戊酸（MVA）下游途徑的大腸桿菌Trc-low為出發(fā)菌株；（2）設(shè)計(jì)葎草酮合成代謝途徑和方案，并確定合適的酶基因，在已知酶基因的基礎(chǔ)上加上其它所需表達(dá)元件；（3）合成葎草酮代謝途徑所需酶基因，并構(gòu)建到合適的質(zhì)粒載體上；（4）將表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌Trc-low中，通過搖瓶發(fā)酵進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)葎草酮；（5）分離出發(fā)酵產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行分子量和結(jié)構(gòu)的鑒定，以驗(yàn)證代謝途徑的可行性和正確性；（6）改變菌株發(fā)酵條件，以達(dá)到優(yōu)化菌株生產(chǎn)葎草酮的目的；（7）放大菌株的發(fā)酵水平，以期達(dá)到增量生產(chǎn)葎草酮。圖1-3研究技術(shù)路線Fig.1-3Technologyroutefortheresearch

青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文232.3.1.2pACYDuet-1-CCL2-VPS-PT2表達(dá)載體設(shè)計(jì)依據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存質(zhì)粒，以及各種質(zhì)粒載體的表達(dá)特性，實(shí)驗(yàn)選擇了pACYDuet-1質(zhì)粒載體，它是大腸桿菌宿主內(nèi)的一種常見的蛋白雙基因表達(dá)載體，還具有構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，本身含有的啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子，在宿主細(xì)胞中高表達(dá)是它的優(yōu)良特性，而氯霉素抗性是它本身自帶的。研究過程中之所以選擇pACYDuet-1質(zhì)粒搭載CCL2-VPS-PT2基因片段，是因?yàn)樗母弑磉_(dá)性，可以更好的表達(dá)質(zhì)粒上連接的三個(gè)重要酶：戊-苯酮合酶（VPS）、羧基輔酶A連接酶（CCL2）、異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶-2（PT2），以利于產(chǎn)物的生成。選擇好合適的質(zhì)粒后，需要根據(jù)質(zhì)粒堿基序列和目的基因堿基序列的特性來進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，pACYDuet-1質(zhì)粒載體已知包含有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，即有了兩處可以連接目的基因片段的位置，且質(zhì)粒上已經(jīng)具備了基本的目的基因表達(dá)元件T7啟動(dòng)子和RBS位點(diǎn)等，將羧基輔酶A連接酶（CCL2）以及異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶-2（PT2）分別克隆到兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，再克隆已經(jīng)設(shè)計(jì)好的戊-苯酮合酶（VPS）到已經(jīng)連接了羧基輔酶A連接酶（CCL2）的多克隆位點(diǎn)，最后，得到了一個(gè)完整的包含了我們所需要的三個(gè)目的基因的表達(dá)載體，構(gòu)建的表達(dá)載體的具體片段特征已經(jīng)表示下圖中。圖2-1pACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT2表達(dá)載體Fig.2-1TheexpressionvectorofpACYCDuet-1-CCL2-VPS-PT22.3.2pTrcHis2B-IDI-PT1-Monooxygenase載體的構(gòu)建2.3.2.1基因和載體的設(shè)計(jì)（1）IDI基因的設(shè)計(jì)根據(jù)啤酒花中葎草酮的代謝途徑，目標(biāo)產(chǎn)物葎草酮的合成過程中需要添加二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）到間苯三酚衍生物間苯異戊二酮（PIVP）上。因此，


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