漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶,具有作用底物廣泛、產(chǎn)物無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),在食品制造、紡織印染、生物傳感器等領(lǐng)域均具有極佳的應(yīng)用潛力。漆酶同工酶LACC2和LACC6是阿魏蘑漆酶的主要組成成分,在阿魏蘑（Pleurotus eryngii var.ferulae）與膠紅酵母（Rhodotorulla mucilaginosa）共培養(yǎng)提高漆酶表達(dá)水平的過(guò)程中,LACC2和LACC6的基因轉(zhuǎn)錄水平分別發(fā)生明顯的上和下調(diào)。本論文圍繞LACC2和LACC6進(jìn)一步展開(kāi)酶學(xué)性質(zhì)等方面的探究,為共培養(yǎng)促進(jìn)漆酶生產(chǎn)的機(jī)理研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:（1）將基因lacc2和lacc6分別與表達(dá)載體pPIC9K相連,轉(zhuǎn)化至畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受態(tài)細(xì)胞中,獲得重組菌株P(guān).pastoris GS115/pPIC9K-lacc2和P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc6。通過(guò)對(duì)漆酶基因信號(hào)肽序列的切除以及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,得到具有高漆酶表達(dá)量的兩株重組菌株,酶活分別達(dá)到351.75 U·L^-1和857... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

提高漆酶表達(dá)水平的措施Figure1-1Strategiesforincreasingtheexpressionleveloflaccases

第二章材料與方法112.2.3大腸桿菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建將基因片段sspoxa3a和sspoxa3b與表達(dá)載體pET28a分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，16℃連接8~12h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-sspoxa3a和pET28a-sspoxa3b并將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，選擇片段大小正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送至公司進(jìn)行測(cè)序。整個(gè)構(gòu)建流程如圖2-2所示。圖2-1畢赤酵母重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖Figure2-1TheprocessofconstructingP.pastorisrecombinantvector

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文122.2.4重組質(zhì)粒的異源表達(dá)2.2.4.1重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的異源表達(dá)以下方法以重組質(zhì)粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6的表達(dá)過(guò)程為例，重組質(zhì)粒pPIC9K-sspoxa3a和pPIC9K-sspoxa3b的異源表達(dá)方式與之相同。（1）電轉(zhuǎn)化畢赤酵母利用StuI線性化空質(zhì)粒pPIC9K、重組質(zhì)粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6，并純化回收。提前參照文獻(xiàn)[75]的方法制備畢赤酵母GS115感受態(tài)，將線性化后的質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，后培養(yǎng)2.5h再將菌液涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)36h。（2）高拷貝數(shù)重組菌的篩選從MD平板中隨機(jī)挑選出單菌落至帶有G418抗性的YPD平板上，并逐步提高G418濃度（0.25、1、2、4mg·mL-1）以篩選高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。挑選在4mg·mL-1G418濃度的YPD平板上生長(zhǎng)的酵母轉(zhuǎn)化子P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6，提取其基因組進(jìn)行菌落PCR。（3）ABTS變性板的篩選將對(duì)照菌株P(guān).pastorisGS115/pPIC9K，重組菌株P(guān).pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6分別接種至提前添加了ABTS的BMMY平板上，在平皿蓋上滴加200μL甲醇，30℃培養(yǎng)箱中倒置且避光培養(yǎng)48h，觀察是否會(huì)有墨綠色的變色圈出現(xiàn)。（4）重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)將篩得的重組菌株P(guān).pastorisGS115/pPIC9K-lacc2、P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6和轉(zhuǎn)入了空質(zhì)粒的對(duì)照組菌株P(guān).pastorisGS115/pPIC9K接種至YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃、250r·min-1的條件下培養(yǎng)24h。以3.0%的接種量轉(zhuǎn)接到BMGY培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)18h，以6000r·min-1的速度離心5min，收集菌體轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基中，繼圖2-2大腸桿菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖Figure2-2TheprocessofconstructingE.colirecombinantvector

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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