蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,簡稱SPase）作為一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,能夠以蔗糖為供體、葡萄糖為受體,通過轉(zhuǎn)苷反應制備曲二糖。曲二糖具有促進腸道益生菌生長、抑制α-葡萄糖苷酶活性及延緩碳水化合物消化吸收等功能,在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應用潛力,通常采取SPase等合成曲二糖。然而,目前報道的SPase僅在大腸桿菌中異源表達,并不適用于食品工業(yè)應用,而枯草芽孢桿菌（B.subtilis）作為食品安全宿主則是表達SPase的更佳選擇。本研究首次將青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）來源的蔗糖磷酸化酶在B.subtilis WS11中異源表達,研究了SPase作為一種天然胞內(nèi)酶卻被分泌至胞外的原因,并對其酶學性質(zhì)進行研究。在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化重組酶制備曲二糖的工藝。此外,采用多種固定化載體對SPase進行固定化,獲得了較好的固定化效果。主要研究結(jié)果如下:（1）構(gòu)建重組菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase和B.subtilis/pHY300PLK-SPase,其中重組菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase搖瓶... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

曲二糖結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Structuresofkojibiose

(a) (b)圖 1-2 蔗糖磷酸化酶的晶體結(jié)構(gòu)(a): 蔗糖磷酸化酶結(jié)構(gòu)域；(b): 蔗糖磷酸化酶活性位點Fig. 1-2 Crystal structure of sucrose phosphorylase(a): the domains of sucrose phosphorylase; (b): the active site of sucrose phosphorylase其中，A 結(jié)構(gòu)域(1-85、167-291 和 356-435 位殘基)是存在于 GH13 家族的典型結(jié)構(gòu)β/ɑ)8桶結(jié)構(gòu)，由 8 個相互平行的 ɑ-螺旋和 β-折疊組成，含此結(jié)構(gòu)的酶的特性之一在于接螺旋到折疊的 loops 的平均長度要比連接折疊到螺旋的 loops 短。B 結(jié)構(gòu)域(86-166殘基)：主要是兩個短的 ɑ-螺旋和兩個反向平行的 β-折疊。B’結(jié)構(gòu)域(292-355 位殘基)要是盤繞區(qū)域，包含一個長 ɑ-螺旋和一個短 ɑ-螺旋，這種拓撲結(jié)構(gòu)的存在，不利于寡的結(jié)合，同時減少了底物結(jié)合的通道，因此這個結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)酶功能上有重要意義。 結(jié)構(gòu)域：C 端的前 56 個氨基酸殘基構(gòu)成一個五股反向平行的 β-折疊，這是 GH13 家其他成員中未發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域。盡管完整的序列含有 2 個半胱氨酸(Cys)殘基，但并未在結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)二硫鍵，這是由于其中一個 Cys356 殘基位于蛋白結(jié)構(gòu)的表面，且被氧化砜，而另一個 Cys205 殘基位于酶內(nèi)部。二聚體的形成主要是兩個 B 結(jié)構(gòu)域的相互作

圖 1-3 蔗糖磷酸化酶催化機理Fig. 1-3 Catalytic mechanism of sucrose phosphorylase磷酸化酶的催化機理如圖 1-3 所示，具體如下：ase 作用底物的相關(guān)活性位點，如上圖(A)所示；當蔗糖進入活性中心時，其葡即被 Glu232 質(zhì)子化，同時，Aspl92 親核進攻葡萄糖基的異頭碳原子(B)；然-酶中間體，并釋放果糖(C)；隨后 loop A(336-344 位殘基)上的果糖結(jié)合位 移出，并由磷酸鹽結(jié)合位點 Tyr344 取而代之，且 loop B(130-140)上的磷酸鹽Arg135 進入活性部位，使得蔗糖-酶中間體與磷酸鹽(HPO42-或 H2PO4-)反應，萄糖(D)；與相應受體結(jié)合產(chǎn)生目的產(chǎn)物(E)。SPase 能可逆的催化蔗糖和磷酸糖和 D-葡萄糖-1-P。糖磷酸化酶的來源及應用蔗糖磷酸化酶的來源磷酸化酶主要分布在細菌等微生物中，目前已經(jīng)報道的來源有：腸膜明串珠ostoc mesenteroides)[23-25]、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)[26, 27]、青春雙歧obacterium adolescentis，簡稱 B. adolescentis)[28]、巨大芽孢桿菌(Bac

【參考文獻】：
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碩士論文
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本文編號：3468523