維生素K₂是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚臓I養(yǎng)成分,七烯甲萘醌（Menaquinone-7,MK-7）為其重要形式。MK-7具有促進人體骨代謝和凝血因子生成的作用,可用于預防骨折和治療維生素K缺乏導致的出血性疾病。目前,工業(yè)上合成MK-7的方法主要是化學合成法,但該方法需要額外進行分選純化才能得到具有生物活性MK-7形式,生產(chǎn)成本高。利用微生物發(fā)酵法可以直接得到具有生物活性的MK-7,與化工合成法相比降低了污染,減少了工藝流程�？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）作為革蘭氏陽性模式微生物,其遺傳背景清晰,基因改造方法成熟。在前期研究中,本實驗室對野生型菌株Bacillus subtilis 168的胞內(nèi)代謝途徑進行了模塊化改造并構(gòu)建出一株高產(chǎn)MK-7的重組菌株BS21,搖瓶發(fā)酵實驗的MK-7的產(chǎn)量達244 mg·L^-1,同時發(fā)現(xiàn)BS21中甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（Methylerythritol-4-phosphate pathway,MEP pathway）可能是MK-7合成的限速步驟。MEP途徑是枯草芽孢桿菌合成MK-7側(cè)鏈結(jié)構(gòu)... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

七烯甲萘醌化學結(jié)構(gòu)式Fig.1-1StructureofMenaquinone-7

江南大學碩士學位論文6圖1-2枯草芽孢桿菌胞內(nèi)MK-7合成途徑Fig.1-2ThepathwayofMK-7biosynthesisinB.subtilis1.3.2.1七烯甲萘醌側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的合成甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（Methylerythritol-4-phosphatepathway，MEPpathway）也被稱為非甲羥戊酸途徑。該途徑存在于大多數(shù)細菌，部分真核寄生蟲和植物細胞的質(zhì)體中，是細菌中合成MK-7側(cè)鏈結(jié)構(gòu)異戊二烯單元的唯一途徑。國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)MEP途徑對萜類化合物的生物合成有重要影響，如：半萜(異戊二烯和異戊烯醇)、單萜(檸檬烯)、倍半萜(法尼烯)、二萜(紫杉二烯)、類胡蘿卜素、泛醌和甲萘醌等[71,72]。在枯草芽孢桿菌中，MEP途徑（圖1-2）以3-磷酸甘油醛（G3P）與丙酮酸（PYR）為底物，經(jīng)過七步酶催化反應得到異戊二烯基二磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）。首先，丙酮酸與3-磷酸甘油醛在1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合成酶（Dxs）的催化下縮合生成1-脫氧-D-木糖-5-磷酸（DXP）；隨后DXP被羥酸還原異構(gòu)酶（Dxr）轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP），過程消耗一分子的還原型輔酶Ⅱ（NADPH）。MEP可由2-C-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶（IspD）催化形成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖（CDME），經(jīng)過磷酸化和環(huán)化作用后形成2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸（MEcPP）。MEcPP在4-羥基-3-甲基丁烯-2-烯基二磷酸合酶（IspG）催化作用下轉(zhuǎn)變

江南大學碩士學位論文18圖2-1構(gòu)建重組菌株流程圖Fig.2-1Theflowchartofconstructingrecombinantstrains本文將枯草芽孢桿菌MEP中基因的原始啟動子替換為組成型啟動子P556的操作流程為：在重組BS21DF基礎(chǔ)上將ispH基因原始啟動子替換為組成型啟動子P556得到重組菌株BS21DF5H。在重組BS21DFH基礎(chǔ)上將ispE和ispG基因原始啟動子替換為組成型啟動子P556得到重組菌株BS21DFH5E和BS21DFH5G。在重組BS21DF5E基礎(chǔ)上將ispH基因原始啟動子替換為組成型啟動子P556得到重組菌株BS21DF5E5H。重組菌株構(gòu)建具體步驟：利用Spizizen轉(zhuǎn)化法制作感受態(tài)枯草桿菌細胞，將按照本文2.2.2中敘述的敲除框片段構(gòu)建方法融合得到完整的目的基因敲除框DNA片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)枯草桿菌細胞。于表達框中P43組成型啟動子前的序列中選取一段DNA序列作為驗證融合基因表達框是否整合至基因組目標位點的上游引物，命名為43.VF；分別于ispD、ispE、ispF、ispG和ispH基因編碼序列中選取一段合適的DNA序列作為驗證融合基因表達框是否整合至基因組目標位點的下游引物，命名為43D.VR、43E.VR、43F.VR、43G.VR和43H.VR。將引物43.VF與VR引物分別配對對抗性平板長出的重組菌株進行單菌落PCR驗證，得到的DNA片段送由金唯智公司進行測序，片段測序確認正確后將PDG148質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入陽性轉(zhuǎn)化子內(nèi)，促進lox71和lox66的重組，將抗性標記盒去除。最后，50℃孵育12h，胞內(nèi)溫敏性質(zhì)粒PDG148丟失，將菌種保存于-80℃冰箱中備用。2.3.3重組菌株搖瓶發(fā)酵實驗取保存于-80℃冰箱中的保菌管，將菌種劃線于含LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日從培養(yǎng)皿中挑取一環(huán)重組菌株，接種至含3mL液體LB培養(yǎng)基的15mL試管中以220rpm的速度振蕩培養(yǎng)8h作為發(fā)酵種子液。每個250mL的

【參考文獻】：
期刊論文
[1]產(chǎn)Surfactin芽孢桿菌的篩選及特性研究[J]. 李彥林,張蔚,李曉玉,魯心怡,曹鈺.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2019(13)
[2]枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)VK2的技術(shù)工藝條件初探[J]. 李拖平,郭梅,王娜,陳積星.  食品科學. 2008(11)
[3]維生素K2在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的作用[J]. 羅曉茹.  國外醫(yī)學.藥學分冊. 2006(05)
[4]hprK基因敲除及對其枯草芽孢桿菌核黃素發(fā)酵的影響[J]. 張帆,宋輝,班睿.  生物工程學報. 2006(04)
[5]維生素K2的研究進展[J]. 鄒志強.  中國骨質(zhì)疏松雜志. 2005(03)
[6]維生素K生產(chǎn)工藝進展[J]. 張華峰,張華強,陳天華,儀宏,魏弟,秦樂樂.  飼料工業(yè). 2004(01)



本文編號：3466029