氧化應(yīng)激（oxidative stress）是由活性氧類（reactive oxygen species,ROS）引起。ROS是生物體通過氧化代謝或由一些專一性酶類產(chǎn)生的一類化學(xué)活性極強(qiáng)的小分子物質(zhì),包括超氧化物陰離子（O₂^-）、過氧化氫（H₂O₂）和羥基自由基（·OH）。以往關(guān)于微生物氧化應(yīng)激的研究,主要關(guān)注抗氧化體系如OxyR和SoxRS轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的應(yīng)激機(jī)制。但是對于微生物中過氧化物酶EfeB在氧化應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制,尚未被闡明。本研究以大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）為研究對象,以EfeB為調(diào)控目標(biāo),通過efeB的過表達(dá)與缺失,探究外源添加H₂O₂和ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）對胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響以及EfeB在其中發(fā)揮的作用。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:（1）氧化應(yīng)激條件的確立及ROS測定方法的改進(jìn)。通過外源添加不同濃度的H₂O₂或ε-PL測得出發(fā)菌株的生長... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

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大腸桿菌的氧化應(yīng)激機(jī)制Fig.1-1MechanismofoxidativestressinE.coli

第一章緒論31.3.1氧化應(yīng)激調(diào)控子當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，會產(chǎn)生大量的ROS，此時抗氧化防御體系失衡。過度產(chǎn)生的ROS對細(xì)胞存在著潛在的危害，因此細(xì)菌進(jìn)化出復(fù)雜的監(jiān)測ROS水平并且激活相關(guān)機(jī)制的抗氧化防御基因，從而避免氧化傷害或者對損傷部位進(jìn)行修復(fù)，如圖1-2所示。大腸桿菌和其他細(xì)菌可以利用各種氧化劑的有害影響蛋白質(zhì)中的氧化損傷作為生理信號觸發(fā)全局抗氧化反應(yīng)，響應(yīng)ROS的調(diào)節(jié)基因分子機(jī)制由SoxR和OxyR兩個最有特色的氧化還原感應(yīng)引起的氧化還原應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子組成[21]。兩種蛋白質(zhì)都可以直接將氧化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至基因調(diào)控。正常狀態(tài)下兩種蛋白均在處于非活躍狀態(tài)，只有在特定類型的氧化應(yīng)激下這兩種蛋白會在細(xì)胞中被短暫激活。OxyR和SoxR蛋白可以增強(qiáng)其產(chǎn)物的基因的轉(zhuǎn)錄，從而消除并修復(fù)ROS所帶來的氧化損傷，維持細(xì)胞正常生理代謝活動[22]。圖1-2細(xì)菌對氧化脅迫應(yīng)答的簡單機(jī)制Fig.1-2Simplemechanismofbacterialresponsetooxidativestress1.3.1.1SoxRS調(diào)控子應(yīng)答轉(zhuǎn)錄機(jī)制SoxR在大腸桿菌中的調(diào)控機(jī)理已被廣泛研究。在溶液中，SoxR是同型二聚體，每個亞基均含有[2Fe-2S]簇[23,24]，僅當(dāng)[2Fe-2S]簇被氧化為[2Fe-2S]2+時，才會賦予SoxR的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而激活soxS表達(dá)SoxR[25,26]。SoxR是大腸桿菌科的保守調(diào)節(jié)子，屬于MerR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，分子量為17kD[27]，是感知壓力的反應(yīng)信號開關(guān)，例如氧化應(yīng)激，重金屬或抗生素均會激活相關(guān)基因的表達(dá)，因此在氧化應(yīng)激方面SoxR被確定為O2壓力傳感器[28,29]，經(jīng)進(jìn)一步的研究表明，SoxR可以通過一氧化氮以及各種內(nèi)源性和異源性氧化還原劑所激活[30,31]。此外，SoxR通過鳥嘌呤自由基通過DNA介導(dǎo)的氧化而被激活[32]。在大腸桿菌中，SoxRS應(yīng)答涉及約100個基因，其轉(zhuǎn)錄受SoxR通過激活

第二章材料與方法11圖2-1重組質(zhì)粒示意圖Fig.2-1Schemeofrecombinantplasmid2.2.1.2重組菌株Eco/pEF的蛋白表達(dá)及SDS-PAGE檢測（1）將構(gòu)建好的重組菌株于及對照菌株于37°C、200r·min-1，搖床培養(yǎng)，過夜活化。（2）第二天按1%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至50mLLB液體培養(yǎng)基250mL搖瓶中，重組菌株的LB液體培養(yǎng)基中含終濃度為50μg·mL-1Kan抗性，37°C、200r·min-1，搖床培養(yǎng)，第2h時加入終濃度為0.2mmol·L-1的IPTG，對照菌株不添加IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5h。（3）誘導(dǎo)結(jié)束后，8000r·min-1離心10min收集菌體，之后用PBS緩沖液洗滌菌體一次，最后用PBS緩沖液懸浮菌體，并進(jìn)行超聲破碎。（4）破碎后，取一定量的溶液作為全細(xì)胞破碎樣品，其中出發(fā)菌株和未添加IPTG的重組菌株為空白對照樣品。（5）將上述三種樣品置于沸水浴中加熱10min，取出樣品冷卻至室溫后，12000r·min-1離心10min，之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。2.2.2過氧化物酶efeB基因的敲除利用Red同源重組的原理，并參照Datsenko[68]等人的實驗方法，設(shè)計實驗方案進(jìn)行過氧化物酶efeB基因的敲除。實驗流程如下：2.2.2.1引物設(shè)計及打靶片段的擴(kuò)增以E.coli的基因組為模板，設(shè)計目的基因efeB上下各500bp的同源序列的引物。分別用引物對UefeBF/UefeBR和DefeBF/DefeBR擴(kuò)增出efeB上游的同源序列基因UefeB和下游的同源序列基因DefeB，并以pKD4質(zhì)粒為模板設(shè)計引物kanF和kanR，擴(kuò)增含有Kan抗性片段及其兩端FRT基因片段。將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI酶切后的線性質(zhì)粒pET22b與以上擴(kuò)增出的三個基因片段利用諾唯贊ClonExpressMultiSOneStepCloningKit試劑盒進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliJ感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布在Kan和Amp雙抗平板上過夜培養(yǎng)篩選陽性轉(zhuǎn)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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