親和色譜法作為一種基于生物分子識(shí)別原理的純化工具,可一步純化得到高純度和高收率的重組蛋白。然而,對(duì)于大多數(shù)重組蛋白而言,往往難以獲得合適的親和配基。為了發(fā)展一種廣譜、通用的親和純化技術(shù)用于重組蛋白高效純化,本論文探索了納米抗體的肽標(biāo)簽免疫識(shí)別系統(tǒng)作為親和層析平臺(tái)的可行性。本論文通過原核表達(dá)制備了兩種能夠特異性識(shí)別肽標(biāo)簽的納米抗體（BC2-nb和Syn2-nb）,將兩種納米抗體通過氨基固載的方式固定在瓊脂糖凝膠上,eGFP-BC2T和eGFP-EPEA為模型蛋白,考察并比較了兩種納米抗體免疫親和柱的靜態(tài)吸附性能、柱吸附和洗脫行為,同時(shí)探討了不同pH條件和不同鹽濃度對(duì)eGFP-BC2T和eGFP-EPEA吸附的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:（1）兩種納米抗體及模式蛋白的表達(dá)純化與親和力測定:成功地將融合His₆-tag的BC2-nb和Syn2-nb納米抗體轉(zhuǎn)化至E.coli ShuffleT7（DE3）中,并且可溶表達(dá),目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量為80⁹0 mg/L發(fā)酵液,純度可達(dá)85%以上。eGFP-BC2T和eGFP-EPEA兩種可溶的模式蛋白約占細(xì)胞破... 

【文章來源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 抗體藥物分離純化
        1.1.1 概述
        1.1.2 抗體藥物的純化過程
        1.1.3 抗體純化的一般方法
    1.2 免疫親和層析技術(shù)
        1.2.1 免疫親和層析介質(zhì)
        1.2.2 免疫親和層析配基
        1.2.3 親和標(biāo)簽
            1.2.3.1 蛋白標(biāo)簽
            1.2.3.2 短肽標(biāo)簽
    1.3 納米抗體
        1.3.1 納米抗體概述
        1.3.2 納米抗體的生物學(xué)特性
        1.3.3 納米抗體的應(yīng)用
        1.3.4 BC2-nb和 BC2T親和標(biāo)簽識(shí)別體系簡介
        1.3.5 Syn2-nb和 EPEA親和標(biāo)簽識(shí)別體系簡介
    1.4 本論文研究目的、意義
2 兩種納米抗體和親和標(biāo)簽識(shí)別體系的制備及活性檢測
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        2.2.1 材料與試劑
        2.2.2 主要儀器及耗材
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 BC2-nb和 Syn2-nb重組序列構(gòu)建
        2.3.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA重組序列構(gòu)建
        2.3.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.3.4 重組蛋白的表達(dá)與純化
        2.3.5 菌體的破碎
        2.3.6 SDS-PAGE電泳
        2.3.7 IMAC純化目標(biāo)蛋白
        2.3.8 蛋白質(zhì)濃度的測定方法
        2.3.9 蛋白質(zhì)純度的測定方法
        2.3.10 納米抗體親和力測定
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.4.1 BC2-nb和 Syn2-nb的表達(dá)與純化
        2.4.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA的表達(dá)與純化
        2.4.3 納米抗體的親和力測定
    2.5 本章小結(jié)
3 免疫吸附柱的制備和性能評(píng)價(jià)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.2.1 材料與試劑
        3.2.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及耗材
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 兩種免疫親和介質(zhì)的制備
        3.3.2 洗脫條件的優(yōu)化
        3.3.3 兩種免疫親和介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量測定
        3.3.4 吸附等溫線測定
        3.3.5 蛋白質(zhì)定量分析
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.4.1 兩種免疫親和介質(zhì)的制備
        3.4.2 洗脫緩沖液的優(yōu)化
        3.4.3 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量測定
        3.4.4 等溫吸附曲線的測定
    3.5 本章小結(jié)
4 免疫親和介質(zhì)的實(shí)際使用效果評(píng)價(jià)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.2.1 材料與試劑
        4.2.2 主要儀器及耗材
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 從細(xì)胞破碎液中一步純化目標(biāo)蛋白
        4.3.2 目標(biāo)蛋白精制純化
        4.3.3 兩種免疫親和介質(zhì)的循環(huán)使用次數(shù)測定
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        4.4.1 從細(xì)胞破碎液中一步純化目標(biāo)蛋白
        4.4.2 目標(biāo)蛋白精純
        4.4.3 免疫親和柱循環(huán)使用次數(shù)
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 納米抗體及模式蛋白序列
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝



本文編號(hào)：3441083