親和色譜法作為一種基于生物分子識別原理的純化工具,可一步純化得到高純度和高收率的重組蛋白。然而,對于大多數(shù)重組蛋白而言,往往難以獲得合適的親和配基。為了發(fā)展一種廣譜、通用的親和純化技術用于重組蛋白高效純化,本論文探索了納米抗體的肽標簽免疫識別系統(tǒng)作為親和層析平臺的可行性。本論文通過原核表達制備了兩種能夠特異性識別肽標簽的納米抗體（BC2-nb和Syn2-nb）,將兩種納米抗體通過氨基固載的方式固定在瓊脂糖凝膠上,eGFP-BC2T和eGFP-EPEA為模型蛋白,考察并比較了兩種納米抗體免疫親和柱的靜態(tài)吸附性能、柱吸附和洗脫行為,同時探討了不同pH條件和不同鹽濃度對eGFP-BC2T和eGFP-EPEA吸附的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:（1）兩種納米抗體及模式蛋白的表達純化與親和力測定:成功地將融合His₆-tag的BC2-nb和Syn2-nb納米抗體轉(zhuǎn)化至E.coli ShuffleT7（DE3）中,并且可溶表達,目標蛋白的產(chǎn)量為80⁹0 mg/L發(fā)酵液,純度可達85%以上。eGFP-BC2T和eGFP-EPEA兩種可溶的模式蛋白約占細胞破... 

【文章來源】：大連理工大學遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻綜述
    1.1 抗體藥物分離純化
        1.1.1 概述
        1.1.2 抗體藥物的純化過程
        1.1.3 抗體純化的一般方法
    1.2 免疫親和層析技術
        1.2.1 免疫親和層析介質(zhì)
        1.2.2 免疫親和層析配基
        1.2.3 親和標簽
            1.2.3.1 蛋白標簽
            1.2.3.2 短肽標簽
    1.3 納米抗體
        1.3.1 納米抗體概述
        1.3.2 納米抗體的生物學特性
        1.3.3 納米抗體的應用
        1.3.4 BC2-nb和 BC2T親和標簽識別體系簡介
        1.3.5 Syn2-nb和 EPEA親和標簽識別體系簡介
    1.4 本論文研究目的、意義
2 兩種納米抗體和親和標簽識別體系的制備及活性檢測
    2.1 引言
    2.2 實驗試劑與儀器
        2.2.1 材料與試劑
        2.2.2 主要儀器及耗材
    2.3 實驗方法
        2.3.1 BC2-nb和 Syn2-nb重組序列構(gòu)建
        2.3.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA重組序列構(gòu)建
        2.3.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.3.4 重組蛋白的表達與純化
        2.3.5 菌體的破碎
        2.3.6 SDS-PAGE電泳
        2.3.7 IMAC純化目標蛋白
        2.3.8 蛋白質(zhì)濃度的測定方法
        2.3.9 蛋白質(zhì)純度的測定方法
        2.3.10 納米抗體親和力測定
    2.4 實驗結(jié)果與分析
        2.4.1 BC2-nb和 Syn2-nb的表達與純化
        2.4.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA的表達與純化
        2.4.3 納米抗體的親和力測定
    2.5 本章小結(jié)
3 免疫吸附柱的制備和性能評價
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與設備
        3.2.1 材料與試劑
        3.2.2 主要實驗設備及耗材
    3.3 實驗方法
        3.3.1 兩種免疫親和介質(zhì)的制備
        3.3.2 洗脫條件的優(yōu)化
        3.3.3 兩種免疫親和介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合載量測定
        3.3.4 吸附等溫線測定
        3.3.5 蛋白質(zhì)定量分析
    3.4 實驗結(jié)果與討論
        3.4.1 兩種免疫親和介質(zhì)的制備
        3.4.2 洗脫緩沖液的優(yōu)化
        3.4.3 動態(tài)結(jié)合載量測定
        3.4.4 等溫吸附曲線的測定
    3.5 本章小結(jié)
4 免疫親和介質(zhì)的實際使用效果評價
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與設備
        4.2.1 材料與試劑
        4.2.2 主要儀器及耗材
    4.3 實驗方法
        4.3.1 從細胞破碎液中一步純化目標蛋白
        4.3.2 目標蛋白精制純化
        4.3.3 兩種免疫親和介質(zhì)的循環(huán)使用次數(shù)測定
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 從細胞破碎液中一步純化目標蛋白
        4.4.2 目標蛋白精純
        4.4.3 免疫親和柱循環(huán)使用次數(shù)
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
附錄A 納米抗體及模式蛋白序列
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況
致謝



本文編號：3441083