發(fā)酵過程中經(jīng)常出現(xiàn)細胞產(chǎn)能導致發(fā)酵溫度升高,生長代謝異常,必需冷卻才能正常發(fā)酵,導致能耗大。產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）作為一株優(yōu)良的工業(yè)抗逆菌株,與模式菌株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相比,在高溫下呈現(xiàn)明顯的生長優(yōu)勢,具有良好的高溫脅迫耐受性。啟動子作為基因表達調(diào)控的重要元件,從C.glycerinogenes中篩選高溫誘導啟動子可為工業(yè)酵母菌株改造提供基礎。本論文研究內(nèi)容具體如下:根據(jù)C.glycerinogenes轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結合S.cerevisiae高溫脅迫相關基因的文獻,從C.glycerinogenes中篩選得到了33個潛在的高溫脅迫應答基因,利用熒光定量PCR技術進一步檢測了這些基因在高溫脅迫下基因的相對轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因的轉(zhuǎn)錄水平在高溫脅迫下上調(diào)最為明顯�？寺』�?qū)膯幼?利用在線分析軟件JASPAR數(shù)據(jù)庫分析啟動子序列中的高溫相關轉(zhuǎn)錄因子結合位點,發(fā)現(xiàn)啟動子均有高溫轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特征位點。以綠色熒光蛋白基因GFP為報告基因,構建高溫誘導... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

C.glycerinogenes和S.cerevisiae菌株在高溫脅迫下的耐受性

nogenes菌株，完成不同細胞樣品的RNA提取，并進行反轉(zhuǎn)錄cDNA和qRT-PCR，實時熒光定量PCR結果如圖3-2所示，除了SSK2和SLN1下調(diào)外，其他基因均上調(diào)。在上調(diào)的基因中，相對轉(zhuǎn)錄水平大于5的有三個基因，分別是CWP1、AAC和POT1，轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了11、8.7和5.4倍；相對轉(zhuǎn)錄水平大于3的有三個基因，分別是HSP12、ATP1和INO1，轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了3.4、3.3和3倍；SCL轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了2.1倍；其他基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)較低，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)范圍在1.1-2.0倍。結果表明，CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因受高溫調(diào)控最顯著。圖3-2C.glycerinogenes高溫沖擊后基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.3-2GeneexpressionlevelsofC.glycerinogenesaftershockedwithhightemperatureCWP1編碼細胞壁蛋白相關基因，對維持細胞的形狀和完整性至關重要。已有研究表明，高溫脅迫下S.cerevisiae的細胞壁通過細胞壁完整性信號通路應答以高度調(diào)控和極化的方式重塑，相關的基因表達水平上調(diào)[10]。在C.glycerinogenes受到高溫脅迫時，其表達水平也發(fā)生上調(diào)，表明高溫脅迫時，細胞壁蛋白基因的高表達在酵母細胞中具有相似的表現(xiàn)。AAC和ATP1分別編碼ADP，ATP轉(zhuǎn)運蛋白基因和ATP合成亞基基因，催化ADP與ATP在線粒體內(nèi)膜上的交換，參與ATP的合成，S.cerevisiae在高溫脅迫下，參與ATP合成的相關基因表達水平上調(diào)[62,63]。在C.glycerinogenes受高溫脅迫時，其表達水平發(fā)生上調(diào)，表明C.glycerinogenes遇到高溫脅迫時，通過上

??幔??蠺CA循環(huán)，產(chǎn)生細胞新陳代謝所需的能量[69,70]。在C.glycerinogenes受到熱激時，通過SCL的上調(diào)為細胞生命活動提供能量。選取CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因編碼序列上游的1.5-2.0kbp氨基酸序列利用NNPPS軟件2.4(neuralnetworkpromoterpredictionsoftware，http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)進行啟動子的預測。設計PCR引物，以C.glycerinogenes基因組為模板，用上下游引物分別克隆得到PCgcwp1、PCgaac、PCgpot1、PCghsp12、PCgatp1、PCgino1和PCgscl啟動子片段，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3-3所示，條帶大小與理論結果相符，表明啟動子克隆成功。啟動子片段純化后與pMD19-TSimpleVector質(zhì)粒連接，送至天霖生物科技有限公司完成測序，經(jīng)比對序列驗證正確。圖3-3啟動子瓊脂糖凝膠電泳分析M：DL2503marker；1：PCgcwp1；2：PCgaac；3：PCgpot1；4：PCghsp12；5：PCgatp1；6：PCgino1；7：PCgsclFig.3-3AgarosegelelectrophoresisofpromotersM:DL2503marker;1:PCgcwp1;2:PCgaac;3:PCgpot1;4:PCghsp12;5:PCgatp1;6:PCgino1;7:PCgscl3.1.3高溫誘導啟動子生物信息學分析啟動子在結構上存在差異，核心啟動子元件和上游增強組件的數(shù)量和位置對啟動子的功能存在影響。轉(zhuǎn)錄因子作為控制細胞過程和對環(huán)境條件反應的調(diào)節(jié)因子，通過與啟動子區(qū)域結合或者和其它轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄因子復合體來影響基因的轉(zhuǎn)錄[34]。在

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]產(chǎn)甘油假絲酵母己糖高效跨膜轉(zhuǎn)運研究[D]. 梁展斌.江南大學 2018
[2]溫度誘導釀酒酵母胞壁蛋白質(zhì)的研究[D]. 谷月.大連工業(yè)大學 2015
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本文編號：3400141