目前,染料脫色過氧化物酶家族（Dye-decolorizing peroxidases,DyPs）因能夠?qū)Χ喾N染料廢水進(jìn)行脫色而備受關(guān)注。但是由于受輔基血紅素的限制,該類蛋白在異源表達(dá)時(shí)活性相對(duì)較低,因此,盡可能提高酶蛋白與輔基血紅素的結(jié)合成為關(guān)鍵。本文的研究對(duì)象是褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的染料脫色過氧化物酶（Dye-decolorizing peroxidase from Thermobifida fusca,TfuDyP）,通過與控制大腸桿菌血紅素C5合成途徑中的關(guān)鍵酶基因共表達(dá),在提高血紅素含量的同時(shí),增強(qiáng)酶與輔基血紅素的結(jié)合,最終提高酶活性。進(jìn)而選擇三種分屬于蒽醌類、雙偶氮類、三苯甲烷類的難降解染料:活性藍(lán)19、剛果紅、溴甲酚綠,探究TfuDyP脫色能力,并選擇脫色效果顯著的溴甲酚綠作為底物,優(yōu)化其反應(yīng)條件。由于在大腸桿菌中異源表達(dá)的TfuDyP屬胞內(nèi)酶,酶的獲取需經(jīng)過破碎離心,不利于工業(yè)化的應(yīng)用,因而采用滲透壓蛋白Y（OsmY）蛋白作為載體與TfuDyP融合表達(dá),介導(dǎo)重組蛋白TfuDyP的胞外分泌。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:（1）過表達(dá)血紅素合成途... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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血紅素分子結(jié)構(gòu)式Fig1-1Molecularstructureofheme

第一章緒論5圖1-2血紅素合成途徑[46]Fig1-2Hemesynthesispathway1.2.3血紅素與染料脫色過氧化物酶的關(guān)系血紅素是以卟啉環(huán)為骨架與一分子的亞鐵離子通過化學(xué)鍵形成的絡(luò)合物，能夠?qū)?xì)胞和機(jī)體的生命活動(dòng)的正常進(jìn)行起重要的調(diào)控作用，且在體內(nèi)分布廣泛，在正常情況下，血紅素主要是以輔基的形式與蛋白進(jìn)行結(jié)合，存在與機(jī)體內(nèi)，游離形態(tài)的血紅素含量較低。染料脫色過氧化物酶家族（DyPs）作為以血紅素為輔基的過氧化物酶家族中的一個(gè)新家族成員，對(duì)于多種染料具有脫色能力。該類酶蛋白與其他過氧化物家族成員相似，均是由是多肽和血紅素通過非共價(jià)鍵形式進(jìn)行緊密結(jié)合[19]。DyP只有在脫輔基蛋白與血紅素結(jié)合之后構(gòu)成全蛋白，并以過氧化氫為電子受體，才能發(fā)揮生物學(xué)功能[47]。目前，血紅蛋白的最新研究表明輔基血紅素的充足供應(yīng)是血紅蛋白產(chǎn)生生物功能性的重要方面[48,49]，這些輔基的水平不足導(dǎo)致其酶活性降低[50,51]。因此，在染料脫色過氧化物酶（DyP）得到高效表達(dá)的同時(shí)，盡可能提高酶與血紅素的結(jié)合顯得尤為重要。1.3染料脫色過氧化物酶對(duì)染料的降解1.3.1染料廢水的簡(jiǎn)介染料是一種附著在纖維和其他材料上，并使其獲得顏色的物質(zhì)，大多數(shù)的染料均可以從自然界中獲得，也有少數(shù)通過化學(xué)反應(yīng)人工合成。染料不僅應(yīng)用于各種紡織纖維的染色，同時(shí)廣泛應(yīng)用于造紙、食品、化妝品、皮革、塑料等工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)。隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，全球?qū)τ谌玖系男枨笤絹碓酱螅壳叭蛉玖夏戤a(chǎn)量多達(dá)700萬噸，其中我國(guó)是全球染料生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó)，也正因此印染紡織業(yè)排水量大增，與此同時(shí)有大量環(huán)境有害型的染料廢水被排放到河流水域中，導(dǎo)致自然水域生態(tài)的破壞。我國(guó)生產(chǎn)的染料主要以三種染料為主，即分散染料、活性染料和硫化染料，其中分散染料由于其具

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文162.2.3.2Fe2+外源添量的優(yōu)化FeCl2用無菌水配制并過濾除菌，接種時(shí)在培養(yǎng)基中外源添加終濃度為0、10、20、30、40、50、60μmolL-1的FeCl2，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)方法表達(dá)后，根據(jù)TfuDyP酶活找出最適宜添加量。2.3檢測(cè)方法2.3.1胞內(nèi)血紅素濃度的測(cè)定用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的Na2CO3溶液配制不同濃度的血紅素樣品，后用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值，制作血紅素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2-1。血紅素濃度利用熒光法來檢測(cè)，具體參考陳丹園[77]胞內(nèi)血紅素檢測(cè)方法。圖2-1血紅素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1Thestandardcurveofhemeconcentration2.3.2卟啉類物質(zhì)定性的測(cè)定通過有機(jī)提取對(duì)卟啉類物質(zhì)進(jìn)行定性分析[78]：取15mL誘導(dǎo)后的菌體上清與冰醋酸：乙酸乙酯（1:4）混合液體混合振蕩，離心后將有機(jī)相吸出與3molL-1鹽酸混合振蕩，離心取鹽酸層進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。2.3.3蛋白溶液濃度測(cè)定使用考馬斯染料的Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒，具體操作步驟參考TaKaRaBradfordProteinAssayKit說明書。蛋白溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2-2。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3336818