γ-谷氨�；D(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,GGT）廣泛存在于生物體中,GGT能夠催化γ-谷氨�；D(zhuǎn)移到氨基酸或肽上。微生物來源的GGT底物特異性更廣,這意味在其催化下能夠合成多種γ-谷氨�；被嵫苌锘螂�,這些酶促合成產(chǎn)物在醫(yī)藥食品領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。例如GGT能夠以L-谷氨酰胺和乙胺為底物,催化合成L-茶氨酸。L-茶氨酸是茶葉中的一種主要氨基酸,它具有去苦提鮮改善食品風(fēng)味的功能,在藥品及保健品領(lǐng)域具有極高的開發(fā)價(jià)值。國內(nèi)外對(duì)于L-茶氨酸的需求日益劇增,人們也更加關(guān)注高品質(zhì)GGT的制備。本研究以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens BH072）GGT為研究對(duì)象,將其基因?qū)氲娇莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）中,成功實(shí)現(xiàn)重組GGT在B.subtilis 168中的高效分泌表達(dá)及純化,并對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究分析,最后利用重組酶實(shí)現(xiàn)了L-茶氨酸的生產(chǎn)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:（1）提取B.amyloliquefaciens BH072基因組DNA,以其為模板,擴(kuò)增ggt-6his/ggtΔ_sp

【文章來源】：合肥工業(yè)大學(xué)安徽省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

GGT蛋白結(jié)構(gòu)圖

合肥工業(yè)大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文圖1.2茶氨酸的結(jié)構(gòu)式Figure1.2StructureofTheanine茶氨酸不僅可以提升茶湯鮮爽味，還能降低茶的苦澀味，另外，還具有焦糖香，對(duì)紅茶的香氣也有很好的影響。茶氨酸的味覺閾值僅為0.06%，常見的谷氨酸閾值為0.15%，低閾值意味著極低濃度的茶氨酸仍能被輕易感覺到。研究表明茶氨酸沒有毒性，且攝取量規(guī)定上沒有明顯限制[25]。糖類與茶氨酸能夠形成具有揮發(fā)性香味的物質(zhì)；茶氨酸與谷氨酸、甘氨酸以及丙氨酸等共同作用，能夠極大提升食品鮮味；同時(shí)，可通過添加茶氨酸來抑制咖啡堿和兒茶素的苦澀味。1.2.3L-茶氨酸的生理功能（1）提高認(rèn)知學(xué)習(xí)能力L-茶氨酸能夠與神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生相互作用，實(shí)驗(yàn)表明，L-茶氨酸能夠顯著增加大腦相關(guān)區(qū)域中多巴胺的分泌，同時(shí)減少血清素的分泌從而達(dá)到提高認(rèn)知學(xué)習(xí)能力的效果[26]。Haskell等人報(bào)道了茶氨酸能夠提高認(rèn)知學(xué)習(xí)能力，他們發(fā)現(xiàn)通過茶氨酸與咖啡因結(jié)合使用后試驗(yàn)組相較于對(duì)照組在簡(jiǎn)單反應(yīng)時(shí)間、數(shù)字記憶和句子驗(yàn)證的準(zhǔn)確性方面有了明顯提高[27]。林雪玲等人通過喂食小鼠一定量的L-茶氨酸并進(jìn)行回避測(cè)試、跳臺(tái)測(cè)試、復(fù)雜水迷宮等行為測(cè)試，發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸能夠提高小鼠的學(xué)習(xí)能力、記憶能力以及認(rèn)知能力，并且提出L-茶氨酸能夠活化腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺，從而提高小鼠的認(rèn)知學(xué)習(xí)能力[28]。（2）保護(hù)腦神經(jīng)流行病學(xué)研究表明，飲茶者患中風(fēng)的可能性顯著降低，初步表明L-茶氨酸能對(duì)腦神經(jīng)產(chǎn)生影響。Kakuda等人報(bào)道了L-茶氨酸預(yù)處理對(duì)于側(cè)腦室誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)缺血的實(shí)驗(yàn)中能夠顯著降低缺血神經(jīng)元的死亡，且呈劑量依賴性[29]。Zukhurova等人進(jìn)行了大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)，阻斷大鼠動(dòng)脈對(duì)于腦部供血30min，其后在不同時(shí)間進(jìn)行再灌注分析腦神經(jīng)缺損及腦梗面積。研究結(jié)果表明，再灌注

茶樹細(xì)胞或愈傷組織合成茶氨酸。研究者發(fā)現(xiàn)該方法難以應(yīng)用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中，主要原因是該方法成本過高，植物細(xì)胞生長緩慢，產(chǎn)率低以及分離純化復(fù)雜[50]。（4）微生物酶促合成法目前，常用于合成L-茶氨酸研究中的酶主要有四種，根據(jù)其反應(yīng)性質(zhì)可分為兩類：第一類主要催化L-谷氨酸與乙胺進(jìn)行合成反應(yīng)獲得L-茶氨酸，需要ATP參與反應(yīng)，包括谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶；第二類主要催化L-谷氨酰胺與乙胺發(fā)生進(jìn)行�；D(zhuǎn)移反應(yīng)，不需要ATP參與反應(yīng)，包括谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶[15,18]。其反應(yīng)方程式如圖1.3所示。圖1.3酶促合成L-茶氨酸的反應(yīng)方程式Figure1.3ReactionofenzymaticsynthesisofL-theanine①谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶（L-glutaminesynthetase，GS，EC6.3.1.2）催化L-谷氨酸鹽與游離的氨在ATP供能的前提下合成L-谷氨酰胺。來源于細(xì)菌中的GS能夠催化L-谷氨酸與乙胺反應(yīng)合成L-茶氨酸[51]。相關(guān)報(bào)道最早出現(xiàn)在1986年，Tachiki等人利用來源于谷氨酸微球菌的GS催化合成茶氨酸[52]。此后，Yamamoto利用來源于Pseudomonastaetrolens的GS進(jìn)行類似反應(yīng)，其中酶與底物乙胺的連接活性僅為7%。由于反應(yīng)需要ATP參與，為了簡(jiǎn)化ATP補(bǔ)充流程Yamamoto將L-茶氨酸6

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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