發(fā)布時間：2021-07-13 02:20

　　定向固定化的蛋白具有均一的取向,能最大限度地保持蛋白的活性,因此蛋白的定向固定化在工業(yè)生物催化、臨床診斷和蛋白相互作用分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。近年來逐漸開發(fā)一些新的定向固定化方法。生物正交反應(yīng)（如點擊化學(xué)）需要引入非天然氨基酸,內(nèi)含肽切割引入巰基則需要額外分離步驟等、存在產(chǎn)量低等問題,通過酶催化修飾特定的基序/標簽,則需要消耗過量酶,且效率低。因此,目前的定向固定化方法都不適合大規(guī)模應(yīng)用。本文利用Spy Catcher-Spy Tag反應(yīng)特異性地、高效地形成異肽鍵的原理,以開發(fā)一種適用于工業(yè)酶的定向固定化,特別是從發(fā)酵細胞裂解液中目標蛋白直接定向固定化的新方法。此方法首先將Spy Catcher共價地固定在載體上,然后將Spy Tag融合的目標蛋白通過與Spy Catcher的連接反應(yīng),實現(xiàn)目標蛋白的定向固定化。本文選擇廣泛使用的商業(yè)化環(huán)氧載體LX-1000EP,并以紅色熒光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）、戊二�；�-7-氨基頭孢烷酸酰化酶（Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase,GA）和甲酸脫氫酶（Fo... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

蛋白的固定化方法[12]

第一章緒論3穩(wěn)定性[23]，增強其在極端變形條件下的穩(wěn)定性，以及提高酶的負荷[22]。這些性能的提高主要是由于位點特異性蛋白固定化排除了固定化中常出現(xiàn)的多點附著、多方位和空間位阻等問題。圖1-2酶的定向固定化[24]Fig.1.2Biospecificorientedenzymeimmobilization目前的蛋白定向固定化主要通過親和標簽、化學(xué)修飾和生物修飾等幾種方法實現(xiàn)：1.1.3.1通過親和標簽的定向固定化親和標簽是能夠結(jié)合特定蛋白質(zhì)或酶或特定載體的配體。常用的親和標簽及其定向固定化方法如下：1）Concanavalin（ConA），可用于結(jié)合糖基化酶。Wallace和Lovenberg可能是在20世紀70年代中期第一批制備這種固定化酶的科學(xué)家，他們使用Sepharose-boundConA（作為選擇性配體）對多巴胺A-羥化酶進行親和結(jié)合[25]。由于糖基化酶在ConA載體上的結(jié)合是非共價的，可以通過在高濃度的糖/糖苷或酸性pH條件下孵育來消除這種非共價結(jié)合，因此，這種固定化結(jié)合通常是不穩(wěn)定的，會存在固定化酶泄露的問題[26]。2）親和素-生物素相互作用。生物素具有一個融合環(huán)結(jié)構(gòu)，其中包含一個脲基（四氫亞胺）環(huán)和一個由戊酸連接的四氫噻吩環(huán)；親和素亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kDa[27]。一個親和素亞基可以與一個生物素分子形成緊密的非共價鍵，如圖1-3所示，這是一種是已知最強的蛋白質(zhì)-配體相互作用，在強度上非常接近共價鍵[28]，它們除了特殊的配體結(jié)合特性外，還具有良好的耐熱性、抗極端pH、變性和蛋白水解的穩(wěn)定性。利用親和素-生物素相互作用制備固定化蛋白有兩種方法：（1）目的蛋白生物素化，

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文4然后與帶有親和素的載體結(jié)合；（2）目的蛋白融合親和標簽，從而與帶有生物素的載體結(jié)合。雖然親和素/鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)的酶固定化比其他非共價固定化方法可以更緊密地將目標酶與載體結(jié)合，但是該方法與其他非共價固定化方法相比，固定化過程相對復(fù)雜，此外親和素（68kDa）和鏈霉親和素（60kDa）都是大蛋白（四聚體），在融合表達的時候可能會對目的蛋白產(chǎn)生不利影響。圖1-3通過親和素-生物素相互作用將蛋白固定在NP上[29]Fig.1.3Proteinimmobilizationtonanoparticles(NP)viatheinteractionbetweenbiotinandstreptavidin/avidin3）Poly（his）標簽與Co2+/Ni2+之間的相互作用。Poly（his）標簽（6×His-tag）與二價金屬陽離子（Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+或Zn2+）之間的螯合作用，是另一種非共價酶固定化方法（如圖1-4所示）。組氨酸殘基的咪唑環(huán)能與金屬離子配合形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物[30,31]。為了實現(xiàn)目的蛋白的固定化，必須在蛋白的N/C-末端融合6×His-tag，在捕獲二價金屬離子之前，先用次氮基三乙（NTA）或亞氨基二乙酸將載體材料活化。使用這種特殊的非共價方法將酶固定在載體上有幾個優(yōu)點:（1）在固定化前不需要純化目標酶，即含有his標簽的蛋白的細胞裂解液可直接用于固定化；（2）酶在固定后通常能保持其固有的三維結(jié)構(gòu)，因此具有較高的活性；（3）由于咪唑可以很容易地將固定化酶洗脫，因此改性后的載體可以被回收再利用。由于此方法的高特異性和親和性，這種相互作用被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化，被稱為固定化金屬親和層析。而通過His-tag僅固定了少數(shù)幾種酶用于生物催化研究。例如，將辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）固定在NTA-Co2+修飾的金納米粒子上，通過6×His-tag取?

【參考文獻】：
期刊論文
[1]環(huán)氧樹脂固定化鹵醇脫鹵酶的研究[J]. 顧愷,鄒樹平,王志才,鄭裕國.  現(xiàn)代化工. 2016(11)
[2]環(huán)氧樹脂固定化擬南芥腈水解酶NIT的研究[J]. 嵇東情,鄭仁朝,鄭裕國.  精細與專用化學(xué)品. 2015(05)



本文編號：3281138