絲狀真菌由于具有與細菌、酵母不同的獨特優(yōu)點:具有與高等真核生物類似的很強的蛋白外分泌能力,能夠進行正確的各種翻譯后加工,因此被廣泛應用于外源蛋白的高效表達。其中黑曲霉有較高的安全性可以被用于食品藥品等領域,成為研究的熱點。工業(yè)用脂肪酶的重要來源之一是微生物來源的脂肪酶,本實驗室篩選到的一株產(chǎn)脂肪酶的米曲霉菌株WZ007,其脂肪酶基因aol（Gen Bank:KP975533）已成功在大腸桿菌表達系統(tǒng)和巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)進行表達。為了進一步提高的米曲霉脂肪酶基因的表達,本課題嘗試利用農(nóng)桿菌介導的真菌表達系統(tǒng)實現(xiàn)其在黑曲霉中胞外分泌表達,并對其酶學性質(zhì)進行研究,研究結果如下:1、表達米曲霉脂肪酶基因的黑曲霉工程菌的構建。首先將米曲霉脂肪酶aol目的基因與p CAMBIA-Pgpd A-Tcbh1-hph-Ptrp C載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5α,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子測序驗證后再提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)細胞,再PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。將黑曲霉孢子懸浮液與農(nóng)桿菌于22℃共培養(yǎng)48 h,隨后轉(zhuǎn)移到潮霉素B抗性篩選培養(yǎng)基,獲得的黑曲霉陽性轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子的基因... 

【文章來源】：浙江工業(yè)大學浙江省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

AOL基因PCR驗證電泳圖

米曲霉脂肪酶在黑曲霉中的表達研究21因。圖2-2HPH基因PCR驗證電泳圖Fig.2-2Verificationelectrophoresismapofhph泳道M：DL2000Marker;泳道1、2、3和4:hph抗性.以載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC為模板基因進行載體反向PCR，1.0%瓊脂糖凝膠電泳如圖2-3，條帶大小在10000bp左右，大小正確。圖2-3載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC基因PCR驗證電泳圖Fig.2-3VerificationelectrophoresismapofvectorpCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC泳道M：2KplusⅡMarker;泳道1和2:載體基因

米曲霉脂肪酶在黑曲霉中的表達研究21因。圖2-2HPH基因PCR驗證電泳圖Fig.2-2Verificationelectrophoresismapofhph泳道M：DL2000Marker;泳道1、2、3和4:hph抗性.以載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC為模板基因進行載體反向PCR，1.0%瓊脂糖凝膠電泳如圖2-3，條帶大小在10000bp左右，大小正確。圖2-3載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC基因PCR驗證電泳圖Fig.2-3VerificationelectrophoresismapofvectorpCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC泳道M：2KplusⅡMarker;泳道1和2:載體基因

【參考文獻】：
期刊論文
[1]米曲霉脂肪酶催化魚油酯酯交換制備高含量EPA/DHA甘油酯的研究[J]. 鄭建永,張石自,王升帆,李俊,汪釗.  中國油脂. 2017(07)
[2]抗除草劑海帶孢子體培育技術的初步研究[J]. 王愛華,伊鋮鋮,姜國勇,鄒積華,崔從光.  青島農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版). 2017(02)
[3]基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征驗證[J]. 黃靜,賈瑞宗,孔華,郭靜遠,王緒朋,郭安平.  熱帶作物學報. 2017(03)
[4]米曲霉As-W6脂肪酶的分離純化及酶學性質(zhì)研究[J]. 王開萍,李紅衛(wèi),吳娛,唐正江,湯飛,劉國慶.  食品工業(yè)科技. 2015(18)
[5]Tween 80誘導下米曲霉3.5232產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的研究[J]. 劉洪偉,許喜林,李曉鳳.  現(xiàn)代食品科技. 2012(08)
[6]根癌農(nóng)桿菌介導脂肪酶在無孢黑曲霉中的高效表達[J]. 潘力,王云艷,王斌,何攀,李俊星.  華南理工大學學報(自然科學版). 2012(05)
[7]黑曲霉作為細胞工廠:知識準備與技術基礎[J]. 郭艷梅,鄭平,孫際賓.  生物工程學報. 2010(10)
[8]微生物發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的研究進展[J]. 汪小鋒,王俊,楊江科,閆云君.  生物技術通報. 2008(04)
[9]絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化方法[J]. 蘇彩云,靳發(fā)彬,張佳,豐枚枚,張春珍,王紅怡,代明偉.  河北化工. 2007(07)
[10]提高微生物脂肪酶產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性的方法研究[J]. 舒正玉,王愛玲,楊江科,閆云君.  工業(yè)微生物. 2007(03)

博士論文
[1]米曲霉脂肪酶的分離純化、基因克隆、表達及其在維生素A合成中的應用研究[D]. 鄭建永.浙江工業(yè)大學 2015

碩士論文
[1]白曲霉酸性蛋白酶在無孢黒曲霉SH-2中的表達研究[D]. 董文超.華南理工大學 2018
[2]基于CRISPR系統(tǒng)的絲狀真菌基因組快速編輯[D]. 李丹丹.福州大學 2017
[3]產(chǎn)脂肪酶Aspergillus oryzae WZ007的誘變選育及其酶的分離純化[D]. 劉虹才.浙江工業(yè)大學 2012
[4]微生物酶法制備芳氧苯氧丙酸酯類除草劑關鍵手性中間體的研究[D]. 姚俠.浙江工業(yè)大學 2012
[5]產(chǎn)脂肪酶菌株Aspergillus oryzae WZ007的誘變及其發(fā)酵條件的優(yōu)化與應用[D]. 徐瑋.浙江工業(yè)大學 2012
[6]細胞膜電穿孔現(xiàn)象機理研究[D]. 肖華娟.中國科學院研究生院（電工研究所） 2004



本文編號：3228850