發(fā)布時(shí)間：2021-06-13 05:21

　　生物催化α-酮戊二酸（2-KG）為L(zhǎng)-谷氨酸（Glu）的反應(yīng)在有機(jī)合成及檢測(cè)試劑領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。目前鮮有研究生物催化2-KG為Glu的報(bào)道,實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)的關(guān)鍵是找到性質(zhì)優(yōu)良的谷氨酸脫氫酶（GDH）并實(shí)現(xiàn)酶制劑的高效低成本生產(chǎn)。本研究首先依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)GDH野生菌菌種信息和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GDH 進(jìn)行篩選,化學(xué)合成了 BsuGDH、PenGDH、AxyGDH、CsyGDH、CdiGDH、TenGDH六種GDH編碼基因,并構(gòu)建于pET-28a（+）質(zhì)粒上,再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli BL21（DE3）感受態(tài)中成功構(gòu)建出產(chǎn)酶工程菌。通過對(duì)產(chǎn)酶工程菌搖瓶發(fā)酵后的酶蛋白可溶性表達(dá)、粗酶液酶活、粗酶液熱穩(wěn)定性等因素的比較,篩選得到了可溶性表達(dá)好、比酶活高的谷氨酸脫氫酶AxyGDH。隨后對(duì)AxyGDH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征,發(fā)現(xiàn)其最適溫度為60℃、最適pH為8.0,在該條件下比酶活達(dá)到903.1±24.6 U/mg,酶活半衰期為167 h。同時(shí)研究了底物2-KG和NH4+以及常見的金屬離子對(duì)酶活力的影響,隨著反應(yīng)中底物2-KG和NH4+濃度的提高,酶的催化活力先升后降,分別在2-KG濃度為10 ... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１?ｐＥＴ－２８⑴－ＭＯＧＤＨ質(zhì)粒圖譜??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?ｐｌａｓｍｉｄ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐＥＴ－２８（＋）－ＭＯＧＤＨ??

２．３．１．２?ＧＤＨ的異源表達(dá)??在ＬＢ培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵重組工程菌，在２５?°Ｃ、０．５ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ條件下誘??導(dǎo)１６ｈ后進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白電泳分析，蛋白膠圖如圖２．２，酶蛋白理論分子大??小及可溶性表迖情況見表２．２�？芍鍌�(gè)目標(biāo)酶均實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)，其中ＰｅｎＧＤＨ、??ＡｘｙＧＤＨ、ＣｓｙＧＤＨ、ＣｄｉＧＤＨ的可溶性表達(dá)良好

２．３．１．３?ＧＤＨ的熱穩(wěn)定性比較??分別將產(chǎn)ＡｘｙＧＤＨ、ＣｓｙＧＤＨ、ＣｄｉＧＤＨ的三株重組菌的粗酶液在不同溫度??下保存１０?ｍｉｎ后測(cè)定殘余酶活，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖２．４。結(jié)果表明ＡｘｙＧＤＨ在８０?°Ｃ??下保存１０?ｍｉｎ后仍殘余９０％以上的酶活，而ＣｄｉＧＤＨ和ＣｓｙＧＤＨ在３０?°Ｃ下保??存１０?ｍｉｎ后酶活即出現(xiàn)明顯下降，ＡｘｙＧＤＨ的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于ＣｄｉＧＤＨ和??ＣｓｙＧＤＨ，最終選擇ＡｘｙＧＤＨ為最佳模板尋找其他ＧＤＨ。??１１０－１???１?〇〇?－?０－＾?４?＾?￣￣■?■??９０：?廣?？一??－?▲‘?？？入??？?７０：?？?Ｔ?＼??Ｉ６。：???＼??＾?５０?－?ＡｘｙＧＤＨ??０?—？－ＣｄｉＧＤＨ?▲?ｌ??１?４０?：?＊?ＣｓｖＧＤｈＩ?＼?＼??１?３０；??２０－??？??１０－??？??〇?－?▲?▲?▲??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?１??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０?８０?９０?１００?１１０??Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（°Ｃ）??圖２．４溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｓｔａｂｉｌｉｔｙ??１８??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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