L-鳥氨酸（L-Ornithine）是尿素循環(huán)途徑中的中間代謝產(chǎn)物,具有多種關(guān)鍵生理生化功能,在食品,醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域具有廣泛的市場需求。谷氨酸棒狀桿菌SNK118（Corynebacterium glutamicum SNK118）是一株L-精氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌株,本課題組已對其進(jìn)行了全基因組重測序獲得其DNA序列。本論文基于CRISPR-Cpf1系統(tǒng)的基因敲除和基于質(zhì)粒的異源基因重組表達(dá),對C.glutamicum SNK118進(jìn)行系統(tǒng)工程改造用于高產(chǎn)L-鳥氨酸。本論文提供了一種有應(yīng)用前景的高產(chǎn)L-鳥氨酸生產(chǎn)菌株和一種增強谷氨酸棒桿菌中輔因子NADPH的有效方法。（1）為切斷鳥氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,并解除全局反饋阻遏調(diào)控的干擾,將SNK118基因組上的編碼鳥氨酸氨甲�；D(zhuǎn)移酶的基因argF和與其相鄰的編碼精氨酸阻遏物的基因argR同時敲除,獲得菌株KBJ01。在500-mL搖瓶發(fā)酵84 h后,KBJ01菌株的L-鳥氨酸產(chǎn)量為28.24 g·L^?1,是對照株JML04（SNK118ΔargR）的46倍(0.62 g·L^?1)。（2）為增強L-鳥氨酸... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

L-鳥氨酸生物合成途徑的示意圖

圖 2-3 pXMJ19-CsgapC-BsrocG 質(zhì)粒構(gòu)2-3 Construction of pXMJ19-CsgapC-Bsroc株的構(gòu)建建組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化及熱激操作方法1(DE3)中，構(gòu)建重組大腸桿菌。菌的構(gòu)建好的重組質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)方法導(dǎo)入到谷 驗證準(zhǔn)確后，獲得多株重組菌株。瓶發(fā)酵18 系列菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件與過：從谷氨酸棒桿菌菌株凍藏甘油管中溫靜置培養(yǎng)活化 40-48 h，挑取平板

酸棒狀桿菌 SNK118 的改造敲除菌株的構(gòu)建 題 研 究 采 用 CRISPR-Cpf1 基 因 編 輯 技 術(shù) 構(gòu) 建 了 菌 株 C. glutaargFΔargR（KBJ01）和 KBJ01Δncgl2228（KBJ07）。建 argF 和 argR 敲除菌株 KBJ01 argF 和 argR 在谷氨酸棒狀桿菌基因組上的位置相距 48 bp。參照實首先以質(zhì)粒 pJYS3_ΔcrtYf 作為模板通過全質(zhì)粒 PCR 反應(yīng)將 crtYf 基因的 為 argF 基因的 crRNA 序列。Dpn I 消化掉 PCR 產(chǎn)物中的母本質(zhì)粒，消主 E.coli JM109。測序驗證正確后獲得 pJYS3-1 質(zhì)粒。然后，以 pJYS3- 擴增得到不包含 crtYf 基因上下游同源臂的 pJYS3A 片段。同時并m SNK118 基因組為模板擴增出基因 argR 的下游 D 與 argF 上游 U 同源son 組裝法將這 3 個片段組裝連接。構(gòu)建成功獲得質(zhì)粒 pJYS3_ΔargFΔar-1 所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]輔因子代謝工程改造谷氨酸棒桿菌合成L-精氨酸[D]. 占米林.江南大學(xué) 2018
[2]Gibson Assembly方法的構(gòu)建及MEP途徑的組合優(yōu)化[D]. 劉樂山.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 2017



本文編號：3222921