溶菌酶（lysozyme,LYZ）是一種廣泛存在于微生物、動(dòng)植物和人體中的天然抗菌物質(zhì),可以非特異性地溶解致病菌細(xì)胞壁中的黏多糖。溶菌酶在一定程度上可以代替抗生素,減少細(xì)菌耐藥性帶來(lái)的危害,具有良好的應(yīng)用前景,如飼料、化妝品、藥品領(lǐng)域。它主要是通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵,使細(xì)菌細(xì)胞壁裂解死亡,因此也叫做N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。溶菌酶主要作用對(duì)象是肽聚糖層較厚的革蘭氏陽(yáng)性菌,對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌效果較差。目前市售溶菌酶主要利用化學(xué)分離方法從蛋清中獲取,來(lái)源有限,化學(xué)提取的純度較低、損失大,同時(shí)溶菌酶作為一種非廣譜抗菌劑,應(yīng)用存在局限性。目的:本實(shí)驗(yàn)選用較為成熟的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)發(fā)酵表達(dá)來(lái)獲取更高產(chǎn)量高活力的蛋清溶菌酶,滿(mǎn)足現(xiàn)行市場(chǎng)的工業(yè)需求。此外,擴(kuò)寬蛋清溶菌酶的抗菌譜,更有利于產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣和應(yīng)用,同時(shí)也為蛋白質(zhì)的分子改造和性能優(yōu)化提供理論參考。方法:采取密碼子優(yōu)化的策略,獲得高效表達(dá)蛋清溶菌酶的酵母菌株。首先依據(jù)酵母菌屬的密碼子偏好性,對(duì)蛋清溶菌酶的ORF序列（Gene ID:396218）進(jìn)行了部分堿基替換,使其更適于酵母表達(dá)體... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

蛋清溶菌酶序列與優(yōu)化后基因比對(duì)Fig.1Alignmentofeggwhitelysozymesequenceandoptimizedgene

浙江大學(xué)碩士論文結(jié)果與討論203.1.2表達(dá)載體pPIC9K-coEWL的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化公司合成的優(yōu)化蛋清溶菌酶全基因序列為DNA干粉，加水溶解后可直接作為模板使用。以coEWL-F、coEWL-R為引物，PCR大量擴(kuò)增出帶同源臂的coEWL基因的ORF區(qū)段，最終獲得422bp目的基因產(chǎn)物。其核酸膠結(jié)果如圖2所示。擴(kuò)增產(chǎn)物coEWL純化后連接至經(jīng)雙酶切的pPIC9K線(xiàn)性空載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21(DE3)后，抗性平板篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，菌落生長(zhǎng)情況如圖3。隨機(jī)選取一顆陽(yáng)性單克隆抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamHI、SalI雙酶切后，預(yù)計(jì)會(huì)得到2614bp和7037bp大小的片段，結(jié)果如圖4所示。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pPIC9K-coEWL構(gòu)建正確。M:DL5000標(biāo)志物1:雙酶切條帶圖4重組表達(dá)載體pPIC9K-coEWL的雙酶切驗(yàn)證Fig.4IdentificationofpPIC9K-coEWLbydoubledigestionM:DL2000標(biāo)志物1:coEWL擴(kuò)增產(chǎn)物圖2coEWLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2PCRproductofcoEWL圖3大腸桿菌BL21(DE3)轉(zhuǎn)化子Fig.3transformationofBL21(DE3)

浙江大學(xué)碩士論文結(jié)果與討論203.1.2表達(dá)載體pPIC9K-coEWL的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化公司合成的優(yōu)化蛋清溶菌酶全基因序列為DNA干粉，加水溶解后可直接作為模板使用。以coEWL-F、coEWL-R為引物，PCR大量擴(kuò)增出帶同源臂的coEWL基因的ORF區(qū)段，最終獲得422bp目的基因產(chǎn)物。其核酸膠結(jié)果如圖2所示。擴(kuò)增產(chǎn)物coEWL純化后連接至經(jīng)雙酶切的pPIC9K線(xiàn)性空載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21(DE3)后，抗性平板篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，菌落生長(zhǎng)情況如圖3。隨機(jī)選取一顆陽(yáng)性單克隆抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamHI、SalI雙酶切后，預(yù)計(jì)會(huì)得到2614bp和7037bp大小的片段，結(jié)果如圖4所示。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pPIC9K-coEWL構(gòu)建正確。M:DL5000標(biāo)志物1:雙酶切條帶圖4重組表達(dá)載體pPIC9K-coEWL的雙酶切驗(yàn)證Fig.4IdentificationofpPIC9K-coEWLbydoubledigestionM:DL2000標(biāo)志物1:coEWL擴(kuò)增產(chǎn)物圖2coEWLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2PCRproductofcoEWL圖3大腸桿菌BL21(DE3)轉(zhuǎn)化子Fig.3transformationofBL21(DE3)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]榛仁降脂活性肽分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 周美含,郭勇,魏貞,趙蘭,秦漢雄,王輯,閔偉紅.  食品科學(xué). 2019(16)
[3]蛋清溶菌酶改性研究進(jìn)展[J]. 劉紀(jì)紅,馬美湖.  中國(guó)家禽. 2018(15)
[4]基于外泌蛋白質(zhì)組的釀酒酵母信號(hào)肽元件的分析及鑒定[J]. 田雷瑜,曹筠嵩,劉忞之,楊燕,王偉.  中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù). 2018(04)
[5]整體優(yōu)化的信號(hào)肽和人溶菌酶基因在畢赤酵母的高效表達(dá)[J]. 陳珊珊,丁健,李鑫,劉軍,賈祿強(qiáng),槐強(qiáng)強(qiáng),孫佼文,史仲平.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2018(01)
[6]一種豬溶菌酶來(lái)源的抗菌六肽的分離鑒定及其性質(zhì)[J]. 朱德偉,蔡國(guó)林,陸健.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(06)
[7]重組畢赤酵母表達(dá)蛋清溶菌酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 孫瑋遙,宋增健,王向東,林劍.  中國(guó)釀造. 2017 (02)
[8]溶菌酶在防治仔豬大腸桿菌病中的應(yīng)用分析[J]. 張躍海,張明瓊.  當(dāng)代畜牧. 2016(29)
[9]海參i-型溶菌酶在畢赤酵母基因工程菌中優(yōu)化表達(dá)及純化[J]. 馬俊,張洋,叢麗娜,李成.  工業(yè)微生物. 2016(02)
[10]天然微生物防腐劑溶菌酶在食品中的應(yīng)用研究[J]. 崔紅.  中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng). 2015(12)

博士論文
[1]豬溶菌酶的重組表達(dá)及其增效研究[D]. 朱德偉.江南大學(xué) 2017

碩士論文
[1]雞蛋清中溶菌酶的提取及改性研究[D]. 楊曼利.江南大學(xué) 2014
[2]畢赤酵母表達(dá)甘露糖化人溶菌酶研究[D]. 左小虎.安徽大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3222475