氨基葡萄糖（Glucosamine）簡(jiǎn)稱氨糖（Glc N）,廣泛的存在于動(dòng)物、植物以及微生物中。乙酰氨基葡萄糖（Glc NAc）作為Glc N的乙�；a(chǎn)物也有著良好的生產(chǎn)銷售市場(chǎng)。隨著生物學(xué)的發(fā)展,Glc N的生產(chǎn)由傳統(tǒng)的甲殼素水解法逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在比較流行的微生物發(fā)酵法,而后者主要依賴于微生物菌株代謝途徑的改造。本研究首先利用雙啟動(dòng)子載體p ETDuet-1,在E.coli BL21（DE3）菌株中異源過(guò)表達(dá)Glc N合成關(guān)鍵蛋白氨基葡萄糖合成酶（Glms）與乙酰氨基葡萄糖合成酶（Gna1）;其次基于Red同源重組技術(shù),發(fā)現(xiàn)能夠影響大腸桿菌Glc N產(chǎn)量的新基因yoa D與yoa E,探究新基因的缺失對(duì)于Glms酶活以及Glc N產(chǎn)量的影響;最后敲除了Glc N胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因man X,研究了碳源、溫度和p H對(duì)工程菌Glc N合成的影響,具體包括以下三個(gè)方面:（1）氨基葡萄糖合成酶（Glms）與乙酰氨基葡萄糖合成酶（Gna1）是Glc N合成的關(guān)鍵蛋白。本研究使用p ETDuet-1質(zhì)粒對(duì)glms基因（來(lái)源于菌株Bacillus subtilis168）與gna1基因（來(lái)源于菌株S... 

【文章來(lái)源】：齊魯工業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

GlcN與GlcNAc的代謝簡(jiǎn)圖

齊魯工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文7第二章Glms和Gna1的雙啟動(dòng)子共表達(dá)研究2.1引言來(lái)自于枯草芽孢桿菌的glms基因(bsglms)與來(lái)自于釀酒酵母菌株的gna1基因(scgna1)在GlcN的代謝途徑中有著關(guān)鍵的作用。在大腸桿菌基因組中也有著glms基因，但其受到產(chǎn)物GlcN的反饋抑制；本研究使用pETDuet-1作為載體對(duì)基因bsglms與scgna1進(jìn)行異源表達(dá)，構(gòu)建的工程菌株E.coliBL21-pETDuet-1-bsglms-scgna1較E.coliBL21菌株中Glms的酶活有所提高。雙啟動(dòng)質(zhì)粒的構(gòu)建如圖2.1。在第一個(gè)T7啟動(dòng)子后面插入bsglms基因，在第二個(gè)T7啟動(dòng)子后面插入scgna1基因；首先使用NcoI與HindIII酶切pETDuet-1質(zhì)粒后與bsglms基因片段進(jìn)行無(wú)縫克隆連接，從而構(gòu)建工程質(zhì)粒pETDuet-1-bsglms；隨后使用NdeI與XhoI酶切pETDuet-1-bsglms質(zhì)粒后與scgna1基因片段進(jìn)行無(wú)縫克隆連接，構(gòu)建工程質(zhì)粒pETDuet-1-bsglms-scgna1。將工程質(zhì)粒pETDuet-1-bsglms-scgna1轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)后構(gòu)建工程菌株E.coliBL21-pETDuet-1-bsglms-scgna1。圖2.1工程質(zhì)粒pETDuet-1-bsglms-scgna1的構(gòu)建Figure2.1ConstructionofengineeringplasmidpETDuet-1-bsglms-scgna12.2實(shí)驗(yàn)材料2.2.1菌株與質(zhì)粒

齊魯工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文19本論文中酶活定義為：1mL酶液1min內(nèi)催化底物生成1μg谷氨酸的量作為1個(gè)氨糖合成酶活力單位。酶活計(jì)算方式為：U(μg/mL·min)=(C·V1/100)÷(T·V2/1000)，其中公式中的數(shù)字及字母代表的含義詳見(jiàn)表2.19。表2.19酶計(jì)算公式中各參數(shù)的含義Table2.19Themeaningofeachparameterintheenzymecalculationformula參數(shù)名稱含義C谷氨酸的濃度(mg/dL)V1反應(yīng)總體積(120μL)V2反應(yīng)酶液體積(20μL)T反應(yīng)時(shí)間(min)100mg/dL轉(zhuǎn)化為μg/μL的系數(shù)1000μL轉(zhuǎn)化為mL的系數(shù)2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1提取Bacillussubtilis168與SaccharomycescerevisiaeS288c基因組如圖2.2所示是Bacillussubtilis168與SaccharomycescerevisiaeS288c基因組提取完成后的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1，泳道2以及泳道3為Bacillussubtilis168的基因組條帶；泳道4，泳道5以及泳道6為SaccharomycescerevisiaeS288c的基因組條帶。圖2.2枯草芽孢桿菌與釀酒酵母的基因組電泳圖Figure2.2GenomicelectrophoresisofBacillussubtilisandSaccharomycescerevisiae2.4.2提取pETDuet-1質(zhì)粒提取的質(zhì)粒與10×LoadingBuffer按照9:1的比例混勻后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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[3]大腸桿菌代謝途徑的改造對(duì)氨基葡萄糖積累的影響[D]. 董瑞真.齊魯工業(yè)大學(xué) 2018
[4]微型近紅外光譜儀用于氨基葡萄糖關(guān)鍵生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量分析研究[D]. 李燦.山東大學(xué) 2017
[5]乙酰氨基葡萄糖合成關(guān)鍵酶GlmS和Gna1的篩選及催化動(dòng)力學(xué)分析[D]. 徐小芳.江南大學(xué) 2016
[6]生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖[D]. 王雅婷.北京化工大學(xué) 2016
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