由血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus）產(chǎn)生的漆酶耐熱性能良好,具有重要工業(yè)應(yīng)用價值,但該菌所產(chǎn)漆酶活力較低,不適于規(guī)�；a(chǎn)。本文采用基因重組技術(shù),使外源漆酶基因在里氏木霉（Trichoderma reesei）中高效表達(dá),并對重組里氏木霉的產(chǎn)酶性能及其在秸稈、有機污染物降解方面的應(yīng)用進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下:根據(jù)里氏木霉的密碼子偏好性對來自血紅密孔菌的漆酶基因進(jìn)行了優(yōu)化,并將其與里氏木霉強啟動子Pcbh1、終止子Tcbh1和潮霉素抗性基因連接得到重組質(zhì)粒pCH-1ac;再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù),將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到里氏木霉細(xì)胞中。對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)溫度24 ℃,共培養(yǎng)基pH5.2,里氏木霉孢子濃度為107個/mL,共培養(yǎng)周期為60h條件下,介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率最高。通過潮霉素抗性篩選及復(fù)篩得到9個重組轉(zhuǎn)化子。對重組里氏木霉染色體DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）驗證,表明外源漆酶基因已成功整合到里氏木霉的基因組上并可以穩(wěn)定遺傳。對轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液進(jìn)行的SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示:在大約66kDa處有一個明顯的條帶,與血紅密孔菌所產(chǎn)漆酶的條帶... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：121 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 漆酶概述
        1.2.1 漆酶來源
        1.2.2 漆酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機理
            1.2.2.1 漆酶的結(jié)構(gòu)
            1.2.2.2 漆酶的反應(yīng)機理
        1.2.3 漆酶的應(yīng)用
            1.2.3.1 染料脫色
            1.2.3.2 農(nóng)藥降解
            1.2.3.3 木質(zhì)素降解和紙漿漂白
            1.2.3.4 食品加工
            1.2.3.5 制藥行業(yè)
        1.2.4 漆酶的介體
        1.2.5 漆酶的異源表達(dá)
            1.2.5.1 細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)
            1.2.5.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)
            1.2.5.3 絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)
            1.2.5.4 植物表達(dá)系統(tǒng)
    1.3 里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)
        1.3.1 里氏木霉生產(chǎn)的酶
        1.3.2 里氏木霉啟動子Pcbh1
        1.3.3 基因轉(zhuǎn)化方法
            1.3.3.1 原生質(zhì)體法
            1.3.3.2 基因槍法
            1.3.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法
        1.3.4 里氏木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)常用的篩選標(biāo)記
        1.3.5 蛋白質(zhì)糖基化
        1.3.6 里氏木霉對生物質(zhì)原料的利用
    1.4 本課題的研究思路和擬研究內(nèi)容
        1.4.1 本文主要研究內(nèi)容
第二章 外源漆酶基因在里氏木霉中的克隆與表達(dá)
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 試劑
            2.2.2.1 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液
            2.2.2.2 ABTS溶液
        2.2.3 實驗儀器
        2.2.4 培養(yǎng)基
            2.2.4.1 大腸桿菌和農(nóng)桿菌培養(yǎng)基
            2.2.4.2 里氏木霉培養(yǎng)基
        2.2.5 漆酶基因的優(yōu)化
        2.2.6 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌
        2.2.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉
        2.2.9 里氏木霉轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.2.10 里氏木霉轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶實驗
        2.2.11 里氏木霉轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR檢測
        2.2.12 測定方法
            2.2.12.1 漆酶活力的測定
            2.2.12.2 不同因素對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率的影響
            2.2.12.3 發(fā)酵上清液的SDS-PAGE蛋白電泳檢測
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 血紅密孔菌漆酶基因的優(yōu)化
        2.3.2 重組質(zhì)粒pCH-lac的驗證
        2.3.3 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率因素的研究
            2.3.3.1 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響
            2.3.3.2 培養(yǎng)基pH對轉(zhuǎn)化效率的影響
            2.3.3.3 AS濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響
            2.3.3.4 里氏木霉孢子濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響
            2.3.3.5 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響
        2.3.4 里氏木霉轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.3.5 里氏木霉轉(zhuǎn)化子基因組的PCR驗證
        2.3.6 轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶結(jié)果
        2.3.7 酶液的SDS-PAGE蛋白電泳分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 重組里氏木霉產(chǎn)漆酶及其酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌株
        3.2.2 試劑
            3.2.2.1 DNS溶液
        3.2.3 實驗儀器及設(shè)備
        3.2.4 培養(yǎng)基
        3.2.5 產(chǎn)酶實驗
        3.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基組分對重組里氏木霉ZJ09產(chǎn)漆酶的影響
            3.2.6.1 碳源對產(chǎn)酶的影響
            3.2.6.2 氮源種類對產(chǎn)酶的影響
            3.2.6.3 銅離子濃度對產(chǎn)酶的影響
        3.2.7 重組里氏木霉ZJ09液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的條件優(yōu)化
        3.2.8 分批補料發(fā)酵方法
        3.2.9 重組里氏木霉ZJ09所產(chǎn)漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
            3.2.9.1 溫度對重組漆酶活性的影響
            3.2.9.2 重組漆酶的熱穩(wěn)定性研究
            3.2.9.3 pH對重組漆酶活性的影響
            3.2.9.4 重組漆酶的pH穩(wěn)定性研究
            3.2.9.5 金屬離子對重組漆酶活力的影響
            3.2.9.6 有機溶劑對重組漆酶活力的影響
            3.2.9.7 重組漆酶的動力學(xué)常數(shù)測定
        3.2.10 測定方法
            3.2.10.1 漆酶活力的測定
            3.2.10.2 還原糖含量的測定
            3.2.10.3 菌體生物量的測定
        3.2.11 數(shù)據(jù)處理
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分對里氏木霉ZJ09產(chǎn)漆酶的影響
            3.3.1.1 不同可溶性碳源對重組里氏木霉ZJ09產(chǎn)漆酶的影響
            3.3.1.2 不同氮源對重組里氏木霉ZJ09產(chǎn)漆酶的影響
            3.3.1.3 銅離子濃度對重組里氏木霉ZJ09產(chǎn)漆酶的影響
        3.3.2 重組里氏木霉ZJ09搖瓶條件下液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的條件優(yōu)化
            3.3.2.1 發(fā)酵溫度
            3.3.2.2 發(fā)酵液初始pH
            3.3.2.3 接種量
        3.3.3 重組里氏木霉ZJ09產(chǎn)漆酶的時間進(jìn)程
        3.3.4 補料培養(yǎng)的產(chǎn)酶進(jìn)程
        3.3.5 重組漆酶酶學(xué)性質(zhì)的研究
            3.3.5.1 溫度對重組漆酶活力的影響
            3.3.5.2 重組漆酶的熱穩(wěn)定性
            3.3.5.3 pH對重組漆酶活力的影響
            3.3.5.4 重組漆酶的pH穩(wěn)定性
            3.3.5.5 金屬離子對重組漆酶活力的影響
            3.3.5.6 有機溶劑對重組漆酶活力的影響
            3.3.5.7 重組漆酶的動力學(xué)常數(shù)測定
    3.4 本章小結(jié)
第四章 利用重組里氏木霉高效降解秸稈的研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株
        4.2.2 試劑
            4.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液
            4.2.2.2 中性洗滌液
            4.2.2.3 蒽酮溶液
        4.2.3 實驗儀器及設(shè)備
        4.2.4 甘蔗渣和稻草秸稈的氨水預(yù)處理
        4.2.5 培養(yǎng)基
        4.2.6 重組轉(zhuǎn)化子ZJ09固態(tài)發(fā)酵實驗
        4.2.7 測定方法
            4.2.7.1 粗酶液的制備
            4.2.7.2 漆酶活力的測定
            4.2.7.3 還原糖含量的測定
            4.2.7.4 濾紙酶活力的測定
            4.2.7.5 木聚糖酶活力的測定
            4.2.7.6 稻草和甘蔗渣總失重及纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測定
        4.2.8 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 重組里氏木霉以秸稈為主要原料的固態(tài)發(fā)酵研究
            4.3.1.1 培養(yǎng)溫度的影響
            4.3.1.2 培養(yǎng)基初始pH的影響
            4.3.1.3 基質(zhì)含水量的影響
            4.3.1.4 接種量的影響
            4.3.1.5 氨水預(yù)處理的影響
            4.3.1.6 麩皮的加入對于產(chǎn)酶的影響
            4.3.1.7 原始里氏木霉ZU02和重組里氏木霉ZJ09的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果
            4.3.1.8 原始里氏木霉和重組里氏木霉對原料的降解
    4.4 本章小結(jié)
第五章 重組漆酶在環(huán)境污染物治理上的應(yīng)用
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 漆酶
        5.2.2 試劑
            5.2.2.1 染料母液
            5.2.2.2 介體溶液
            5.2.2.3 內(nèi)分泌干擾物母液
        5.2.3 實驗儀器及設(shè)備
        5.2.4 染料脫色實驗
            5.2.4.1 重組漆酶對弱酸性紫N-FBL的脫色實驗
            5.2.4.2 重組漆酶對活性艷藍(lán)KN-R的脫色實驗
            5.2.4.3 重組漆酶對莧菜紅的脫色實驗
        5.2.5 內(nèi)分泌干擾物降解實驗
            5.2.5.1 雙酚A降解實驗
            5.2.5.2 三氯生降解實驗
        5.2.6 測定方法
            5.2.6.1 漆酶活力的測定
            5.2.6.2 染料脫色率的測定
            5.2.6.3 內(nèi)分泌干擾物降解率的測定
        5.2.7 數(shù)據(jù)處理
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 重組漆酶對弱酸性紫N-FBL的脫色
            5.3.1.1 漆酶用量對弱酸性紫N-FBL脫色影響
            5.3.1.2 pH對弱酸性紫N-FBL脫色反應(yīng)的影響
            5.3.1.3 溫度對弱酸性紫N-FBL脫色反應(yīng)的影響
            5.3.1.4 金屬離子及其濃度對弱酸性紫N-FBL脫色反應(yīng)的影響
            5.3.1.5 漆酶對弱酸性紫N-FBL脫色反應(yīng)進(jìn)程
        5.3.2 重組漆酶對活性艷藍(lán)KN-R的降解
        5.3.3 重組漆酶對莧菜紅的脫色
            5.3.3.1 不同介體對莧菜紅脫色的影響
            5.3.3.2 丁香醛濃度對莧菜紅脫色的影響
            5.3.3.3 莧菜紅脫色的時間進(jìn)程
        5.3.4 重組漆酶對雙酚A的降解
            5.3.4.1 不同介體對雙酚A降解的影響
            5.3.4.2 雙酚A降解的時間進(jìn)程
        5.3.5 重組漆酶對三氯生的降解
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
    6.3 論文創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
作者簡歷
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]里氏木霉VPS13基因缺失對菌絲分支、生孢和纖維素酶產(chǎn)量的影響[J]. 劉瑞艷,侯運華,王逸凡,錢遠(yuǎn)超,鐘耀華.  微生物學(xué)報. 2017(10)
[2]里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型轉(zhuǎn)化體系改進(jìn)和β-葡萄糖苷酶的過量表達(dá)[J]. 鐘立霞,錢遠(yuǎn)超,戴美學(xué),鐘耀華.  化工學(xué)報. 2016(06)
[3]大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化[J]. 代軍.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(04)
[4]不同微生物菌劑對芒萁秸稈腐熟過程中腐殖質(zhì)構(gòu)成的影響[J]. 李國平,楊鷺生,王宇晴,趙林艷,湯婉君.  熱帶作物學(xué)報. 2015(04)
[5]磁性Fe3O4/石墨烯異質(zhì)結(jié)固定漆酶特性及其對水中雙酚A的降解研究[J]. 歐陽科,謝珊,趙雅,王雷超,方琪惠.  生態(tài)環(huán)境學(xué)報. 2015(01)
[6]里氏木霉RutC30常溫常壓等離子體（ARTP）誘變篩選pyr4基因缺陷型菌株及轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J]. 安莉穎,易欣欣,秦麗娜,施思,陶勇,伍紅,董志揚.  菌物學(xué)報. 2014(06)
[7]自帶介質(zhì)血紅密孔菌NFZH-1的鑒定及其木質(zhì)素降解特性（英文）[J]. 馮年捷,翟華敏,王傳槐.  林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè). 2014(05)
[8]木質(zhì)纖維素原料中漆酶天然介體的研究進(jìn)展[J]. 邱衛(wèi)華,陳洪章.  生物工程學(xué)報. 2014(05)
[9]漆酶對活性黑KN-B和直接大紅染料的脫色性能[J]. 楊波,杜丹,孫也,汪旭明.  環(huán)境工程學(xué)報. 2013(12)
[10]響應(yīng)面法優(yōu)化水楊酸比色測定還原糖的研究[J]. 朱凱杰,陸國權(quán),張遲.  中國糧油學(xué)報. 2013(08)

碩士論文
[1]漆酶基因lac1338的原核表達(dá)酶學(xué)性質(zhì)及定向進(jìn)化研究[D]. 馮娟.廣東藥學(xué)院 2015
[2]高溫纖維素降解菌的篩選及其復(fù)合菌劑對秸稈降解效果的研究[D]. 王元明.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[3]E.coli高效感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立及誘導(dǎo)型瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建[D]. 楊坤.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010



本文編號：3192455