炎性疼痛是由于各種刺激因素引起肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和神經(jīng)末梢等釋放炎癥因子,引起局部組織炎癥反應。當前治療炎性疼痛的藥物常常因出現(xiàn)耐藥性和副作用而大大影響使用效果。據(jù)以往研究表明,作為兩棲動物的中華大蟾蜍,其皮膚分泌物—蟾酥中含有多種活性物質(zhì),具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等多種藥理活性。但其中關乎該抗炎鎮(zhèn)痛功能的具體因子鮮為人知,因此開展本研究。本研究以中華大蟾蜍為研究對象,首先對蟾蜍的皮膚腺體（耳后腺）進行透射電鏡（TEM）及掃描電鏡（SEM）的觀察,獲取其腺體內(nèi)部的超微結構,并推測其分泌方式為全漿分泌;之后用腺體轉錄組測序和分泌蛋白蛋白組測序和功能注釋的方法對蟾酥多肽的主要功能進行了預測,鑒定出炎性疼痛抑制因子—神經(jīng)肽B（Bg-NPB）。為了驗證該功能預測的可靠性,本研究對蟾酥中鑒定的腫瘤細胞抑制活性進行了檢測,結果顯示蟾酥水提物可以有效地抑制癌細胞的增殖;同時檢測了蟾酥水提物對血管生成的影響,發(fā)現(xiàn)其以劑量依賴性地抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的增殖,并且通過抑制VEGF165-VEGFR2-RAS信號通路發(fā)揮抗血管生成作用,進一步達到腫瘤抑制的作用。因此上述結果驗證了包括鎮(zhèn)... 

【文章來源】：浙江農(nóng)林大學浙江省

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 文獻綜述
    1.1 兩棲動物皮膚分泌物的研究進展
    1.2 蟾酥分泌的器官及方式
    1.3 蟾酥多肽的主要成分
    1.4 蟾酥多肽的藥理活性活性
        1.4.1 抗菌活性
        1.4.2 抗腫瘤活性
        1.4.3 抑制血管生成活性
        1.4.4 其它活性
    1.5 目的及意義
    1.6 科學問題提出
2 蟾酥分泌腺體(耳后腺)的形態(tài)特征
    2.1 試驗材料和儀器
        2.1.1 試驗材料
            2.1.1.1 試驗動物
            2.1.1.2 試驗藥品
        2.1.2 設備及耗材
    2.2 試驗方法
        2.2.1 試劑配制
        2.2.2 耳后腺的超微結構觀察
            2.2.2.1 掃描電鏡的觀察
            2.2.2.2 透射電鏡的觀察
    2.3 結果與分析
        2.3.1 耳后腺掃描電鏡結果
        2.3.2 耳后腺透射電鏡結果
    2.4 小結與討論
3 基于大數(shù)據(jù)分析的蟾酥功能預測及驗證
    3.1 試驗材料和儀器
        3.1.1 試驗材料
            3.1.1.1 試驗動物及細胞
            3.1.1.2 試驗藥品
        3.1.2 設備及耗材
    3.2 試驗方法
        3.2.1 耳后腺轉錄組測序
            3.2.1.1 提取樣品總RNA
            3.2.1.2 測序質(zhì)量數(shù)據(jù)評估
            3.2.1.3 測序堿基質(zhì)量分析
            3.2.1.4 堿基分布檢查
            3.2.1.5 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量預處理
            3.2.1.6 READS污染檢測
            3.2.1.7 DE NOVO拼接
            3.2.1.8 UNIGENE注釋
            3.2.1.9 UNIGENE表達豐度
            3.2.1.10 SSR分析
        3.2.2 蟾酥水提物的腫瘤細胞抑制活性
            3.2.2.1 細胞培養(yǎng)
            3.2.2.2 蟾酥水提物的制備
            3.2.2.3 蟾酥水提物的HPLC分析
            3.2.2.4 蟾酥水提物的腫瘤細胞抑制活性檢測
            3.2.2.5 蟾酥水提物中的蛋白分析
        3.2.3 新鮮蟾酥(FTV)水提物對血管生成的影響
        3.2.4 統(tǒng)計分析
    3.3 結果與分析
        3.3.1 耳后腺轉錄組測序
            3.3.1.1 READS污染檢測
            3.3.1.2 DE NOVO拼接
            3.3.1.3 UNIGENE注釋
        3.3.2 生物學信息分析蟾酥多肽主要功能
        3.3.3 蟾酥水提物的腫瘤細胞抑制活性檢測
        3.3.4 新鮮蟾酥(FTV)水提物對血管生成的影響
    3.4 小結與討論
4 炎性疼痛抑制因子(Bg-NPB)的基因克隆和重組表達
    4.1 試驗材料和儀器
        4.1.1 試驗材料
            4.1.1.1 試驗動物
            4.1.1.2 試驗藥品
        4.1.2 設備及耗材
    4.2 試驗方法
        4.2.1 主要試劑配制
        4.2.2 Bg-NPB的基因克隆
        4.2.3 Bg-NPB基因的重組
        4.2.4 Bg-NPB基因的誘導表達
        4.2.5 Bg-NPB多肽的純化
        4.2.6 SDS-PAGE電泳
    4.3 結果與分析
        4.3.1 Bg-NPB的 c DNA序列分析
        4.3.2 Bg-NPB-p ET-32a表達質(zhì)粒的構建
        4.3.3 Bg-NPB融合基因的表達
    4.4 小結與討論
5 Bg-NPB多肽的炎性疼痛抑制活性
    5.1 小鼠扭體法檢測Bg-NPB多肽活性
        5.1.1 試驗材料和儀器
            5.1.1.1 試驗材料
            5.1.1.2 設備及耗材
        5.1.2 試驗方法
            5.1.2.1 主要試劑配制
            5.1.2.2 小鼠鎮(zhèn)痛實驗
        5.1.3 統(tǒng)計分析
    5.2 大鼠舔足法檢測Bg-NPB多肽活性
        5.2.1 試驗材料和儀器
            5.2.1.1 試驗材料
            5.2.1.2 設備及耗材
        5.2.2 試驗方法
            5.2.2.1 主要試劑配制
            5.2.2.2 動物的處理
        5.2.3 統(tǒng)計分析
    5.3 Bg-NPB多肽對痛覺離子通道的影響
        5.3.1 試驗材料和儀器
            5.3.1.1 試驗材料
            5.3.1.2 設備及耗材
        5.3.2 試驗方法
            5.3.2.1 主要試劑的配制
            5.3.2.2 細胞培養(yǎng)
            5.3.2.3 細胞轉染
            5.3.2.4 爬片準備
            5.3.2.5 膜片鉗試驗
        5.3.3 統(tǒng)計分析
    5.4 結果與分析
        5.4.1 小鼠扭體法檢測Bg-NPB多肽活性
            5.4.1.1 扭體潛伏時間
            5.4.1.2 扭體次數(shù)
        5.4.2 大鼠舔足法檢測Bg-NPB多肽活性
            5.4.2.1 舔足潛伏時間
            5.4.2.2 15min內(nèi)舔足次數(shù)
            5.4.2.3 30min內(nèi)舔足次數(shù)
        5.4.3 Bg-NPB多肽對痛覺離子通道的影響
    5.5 小結與討論
6 Bg-NPB抑制炎性疼痛的分子機制
    6.1 試驗材料和儀器
        6.1.1 試驗材料
            6.1.1.1 試驗動物
            6.1.1.2 試驗藥品
        6.1.2 設備及耗材
    6.2 試驗方法
        6.2.1 主要試劑配制
        6.2.2 酵母雙雜交釣取Bg-NPB受體蛋白
            6.2.2.1 Bg-NPB-p GBKT7 重組質(zhì)粒的構建
        6.2.3 痛覺信號通路
            6.2.3.1 動物組織的蛋白提取
            6.2.3.2 蛋白含量的測定(BCA法)
        6.2.4 統(tǒng)計分析
    6.3 結果與分析
        6.3.1 Bg-NPB-p GBKT7 重組質(zhì)粒的構建
        6.3.2 痛覺蛋白含量的測定
    6.4 小結與討論
7 討論與結論
8 展望
參考文獻
個人簡介
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3175773