炎性疼痛是由于各種刺激因素引起肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和神經(jīng)末梢等釋放炎癥因子,引起局部組織炎癥反應(yīng)。當(dāng)前治療炎性疼痛的藥物常常因出現(xiàn)耐藥性和副作用而大大影響使用效果。據(jù)以往研究表明,作為兩棲動(dòng)物的中華大蟾蜍,其皮膚分泌物—蟾酥中含有多種活性物質(zhì),具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等多種藥理活性。但其中關(guān)乎該抗炎鎮(zhèn)痛功能的具體因子鮮為人知,因此開(kāi)展本研究。本研究以中華大蟾蜍為研究對(duì)象,首先對(duì)蟾蜍的皮膚腺體（耳后腺）進(jìn)行透射電鏡（TEM）及掃描電鏡（SEM）的觀(guān)察,獲取其腺體內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu),并推測(cè)其分泌方式為全漿分泌;之后用腺體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分泌蛋白蛋白組測(cè)序和功能注釋的方法對(duì)蟾酥多肽的主要功能進(jìn)行了預(yù)測(cè),鑒定出炎性疼痛抑制因子—神經(jīng)肽B（Bg-NPB）。為了驗(yàn)證該功能預(yù)測(cè)的可靠性,本研究對(duì)蟾酥中鑒定的腫瘤細(xì)胞抑制活性進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示蟾酥水提物可以有效地抑制癌細(xì)胞的增殖;同時(shí)檢測(cè)了蟾酥水提物對(duì)血管生成的影響,發(fā)現(xiàn)其以劑量依賴(lài)性地抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的增殖,并且通過(guò)抑制VEGF165-VEGFR2-RAS信號(hào)通路發(fā)揮抗血管生成作用,進(jìn)一步達(dá)到腫瘤抑制的作用。因此上述結(jié)果驗(yàn)證了包括鎮(zhèn)... 

【文章來(lái)源】：浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 兩棲動(dòng)物皮膚分泌物的研究進(jìn)展
    1.2 蟾酥分泌的器官及方式
    1.3 蟾酥多肽的主要成分
    1.4 蟾酥多肽的藥理活性活性
        1.4.1 抗菌活性
        1.4.2 抗腫瘤活性
        1.4.3 抑制血管生成活性
        1.4.4 其它活性
    1.5 目的及意義
    1.6 科學(xué)問(wèn)題提出
2 蟾酥分泌腺體(耳后腺)的形態(tài)特征
    2.1 試驗(yàn)材料和儀器
        2.1.1 試驗(yàn)材料
            2.1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            2.1.1.2 試驗(yàn)藥品
        2.1.2 設(shè)備及耗材
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 試劑配制
        2.2.2 耳后腺的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察
            2.2.2.1 掃描電鏡的觀(guān)察
            2.2.2.2 透射電鏡的觀(guān)察
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 耳后腺掃描電鏡結(jié)果
        2.3.2 耳后腺透射電鏡結(jié)果
    2.4 小結(jié)與討論
3 基于大數(shù)據(jù)分析的蟾酥功能預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
    3.1 試驗(yàn)材料和儀器
        3.1.1 試驗(yàn)材料
            3.1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞
            3.1.1.2 試驗(yàn)藥品
        3.1.2 設(shè)備及耗材
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 耳后腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            3.2.1.1 提取樣品總RNA
            3.2.1.2 測(cè)序質(zhì)量數(shù)據(jù)評(píng)估
            3.2.1.3 測(cè)序堿基質(zhì)量分析
            3.2.1.4 堿基分布檢查
            3.2.1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理
            3.2.1.6 READS污染檢測(cè)
            3.2.1.7 DE NOVO拼接
            3.2.1.8 UNIGENE注釋
            3.2.1.9 UNIGENE表達(dá)豐度
            3.2.1.10 SSR分析
        3.2.2 蟾酥水提物的腫瘤細(xì)胞抑制活性
            3.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2.2.2 蟾酥水提物的制備
            3.2.2.3 蟾酥水提物的HPLC分析
            3.2.2.4 蟾酥水提物的腫瘤細(xì)胞抑制活性檢測(cè)
            3.2.2.5 蟾酥水提物中的蛋白分析
        3.2.3 新鮮蟾酥(FTV)水提物對(duì)血管生成的影響
        3.2.4 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 耳后腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            3.3.1.1 READS污染檢測(cè)
            3.3.1.2 DE NOVO拼接
            3.3.1.3 UNIGENE注釋
        3.3.2 生物學(xué)信息分析蟾酥多肽主要功能
        3.3.3 蟾酥水提物的腫瘤細(xì)胞抑制活性檢測(cè)
        3.3.4 新鮮蟾酥(FTV)水提物對(duì)血管生成的影響
    3.4 小結(jié)與討論
4 炎性疼痛抑制因子(Bg-NPB)的基因克隆和重組表達(dá)
    4.1 試驗(yàn)材料和儀器
        4.1.1 試驗(yàn)材料
            4.1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            4.1.1.2 試驗(yàn)藥品
        4.1.2 設(shè)備及耗材
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 主要試劑配制
        4.2.2 Bg-NPB的基因克隆
        4.2.3 Bg-NPB基因的重組
        4.2.4 Bg-NPB基因的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2.5 Bg-NPB多肽的純化
        4.2.6 SDS-PAGE電泳
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 Bg-NPB的 c DNA序列分析
        4.3.2 Bg-NPB-p ET-32a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 Bg-NPB融合基因的表達(dá)
    4.4 小結(jié)與討論
5 Bg-NPB多肽的炎性疼痛抑制活性
    5.1 小鼠扭體法檢測(cè)Bg-NPB多肽活性
        5.1.1 試驗(yàn)材料和儀器
            5.1.1.1 試驗(yàn)材料
            5.1.1.2 設(shè)備及耗材
        5.1.2 試驗(yàn)方法
            5.1.2.1 主要試劑配制
            5.1.2.2 小鼠鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)
        5.1.3 統(tǒng)計(jì)分析
    5.2 大鼠舔足法檢測(cè)Bg-NPB多肽活性
        5.2.1 試驗(yàn)材料和儀器
            5.2.1.1 試驗(yàn)材料
            5.2.1.2 設(shè)備及耗材
        5.2.2 試驗(yàn)方法
            5.2.2.1 主要試劑配制
            5.2.2.2 動(dòng)物的處理
        5.2.3 統(tǒng)計(jì)分析
    5.3 Bg-NPB多肽對(duì)痛覺(jué)離子通道的影響
        5.3.1 試驗(yàn)材料和儀器
            5.3.1.1 試驗(yàn)材料
            5.3.1.2 設(shè)備及耗材
        5.3.2 試驗(yàn)方法
            5.3.2.1 主要試劑的配制
            5.3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            5.3.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            5.3.2.4 爬片準(zhǔn)備
            5.3.2.5 膜片鉗試驗(yàn)
        5.3.3 統(tǒng)計(jì)分析
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 小鼠扭體法檢測(cè)Bg-NPB多肽活性
            5.4.1.1 扭體潛伏時(shí)間
            5.4.1.2 扭體次數(shù)
        5.4.2 大鼠舔足法檢測(cè)Bg-NPB多肽活性
            5.4.2.1 舔足潛伏時(shí)間
            5.4.2.2 15min內(nèi)舔足次數(shù)
            5.4.2.3 30min內(nèi)舔足次數(shù)
        5.4.3 Bg-NPB多肽對(duì)痛覺(jué)離子通道的影響
    5.5 小結(jié)與討論
6 Bg-NPB抑制炎性疼痛的分子機(jī)制
    6.1 試驗(yàn)材料和儀器
        6.1.1 試驗(yàn)材料
            6.1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            6.1.1.2 試驗(yàn)藥品
        6.1.2 設(shè)備及耗材
    6.2 試驗(yàn)方法
        6.2.1 主要試劑配制
        6.2.2 酵母雙雜交釣取Bg-NPB受體蛋白
            6.2.2.1 Bg-NPB-p GBKT7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.2.3 痛覺(jué)信號(hào)通路
            6.2.3.1 動(dòng)物組織的蛋白提取
            6.2.3.2 蛋白含量的測(cè)定(BCA法)
        6.2.4 統(tǒng)計(jì)分析
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 Bg-NPB-p GBKT7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.3.2 痛覺(jué)蛋白含量的測(cè)定
    6.4 小結(jié)與討論
7 討論與結(jié)論
8 展望
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3175773