番茄紅素和β-胡蘿卜素是應(yīng)用最廣泛的兩種類胡蘿卜素。番茄紅素是類胡蘿卜素中最強(qiáng)的單線態(tài)氧猝滅劑,β-胡蘿卜素是人體維生素A的重要前體。二者不但具有鮮艷的紅、橙色澤,更重要的是其具有抗氧化和抗腫瘤等特性。因此,番茄紅素和β-胡蘿卜素被廣泛應(yīng)用于功能食品、醫(yī)藥保健和化妝品等領(lǐng)域,國(guó)際市場(chǎng)需求日益擴(kuò)增。類球紅細(xì)菌,屬于光合細(xì)菌,是研究光合作用和膜蛋白的模式微生物。隨著其遺傳操作方法的成熟和代謝工程技術(shù)的發(fā)展,類球紅細(xì)菌已成功用于多種高附加值化合物的生產(chǎn)。相比于傳統(tǒng)的類胡蘿卜素生產(chǎn)宿主,類球紅細(xì)菌具有許多天然的優(yōu)勢(shì)。首先,類球紅細(xì)菌本身含有類胡蘿卜素合成基因簇,內(nèi)含七個(gè)類胡蘿卜素合成基因,能天然積累多種類胡蘿卜素。其次,類球紅細(xì)菌具有豐富的內(nèi)膜系統(tǒng),這非常有利于類胡蘿卜素在膜上的大量積累。此外,類球紅細(xì)菌可以在厭氧條件下合成類胡蘿卜素,這對(duì)于微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)非常關(guān)鍵,因?yàn)閰捬蹩梢詫?shí)現(xiàn)低碳損,降低生產(chǎn)成本。因此,本研究擬采用類球紅細(xì)菌作為底盤(pán)細(xì)胞工廠,通過(guò)代謝工程改造,實(shí)現(xiàn)類球紅細(xì)菌生物合成番茄紅素和β-胡蘿卜素。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:（1）在類球紅細(xì)菌中構(gòu)建番茄紅素合成途徑。我們選用深紅紅螺菌... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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摘要
Abstract
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第1章 緒論
    1.1 番茄紅素和β-胡蘿卜素簡(jiǎn)介
        1.1.1 番茄紅素的理化性質(zhì)、生理功能及應(yīng)用
        1.1.2 β-胡蘿卜素的理化性質(zhì)、生理功能及應(yīng)用
    1.2 番茄紅素和β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法及現(xiàn)狀
        1.2.1 植物提取
        1.2.2 化學(xué)合成
        1.2.3 微生物發(fā)酵
    1.3 微生物合成番茄紅素和β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展
        1.3.1 天然合成類胡蘿卜素的微生物的研究進(jìn)展
        1.3.2 異源合成類胡蘿卜素的工程菌株的研究進(jìn)展
    1.4 代謝工程的研究進(jìn)展
        1.4.1 調(diào)節(jié)中心代謝途徑
        1.4.2 提高M(jìn)EP途徑的代謝通量
    1.5 類球紅細(xì)菌
        1.5.1 類球紅細(xì)菌的研究及其應(yīng)用
        1.5.2 類球紅細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移及其原理
    1.6 本課題的研究目的、意義和內(nèi)容
        1.6.1 本課題的研究目的、意義
        1.6.2 研究?jī)?nèi)容
第2章 類球紅細(xì)菌中番茄紅素生物合成途徑的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌種、質(zhì)粒和引物
        2.2.2 分子實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒和酶類
        2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)化學(xué)試劑
        2.2.4 培養(yǎng)基及抗生素
        2.2.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法
        2.3.1 類球紅細(xì)菌和深紅紅螺菌的培養(yǎng)及其基因組的提取
        2.3.2 大腸桿菌的培養(yǎng)及質(zhì)粒的提取
        2.3.3 細(xì)菌生長(zhǎng)檢測(cè)及保存
        2.3.4 目的DNA片段的PCR擴(kuò)增
        2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳及DNA回收
        2.3.6 質(zhì)粒的酶切與連接
        2.3.7 大腸桿菌DH5a和S17-1感受態(tài)的制備及其熱激轉(zhuǎn)化
        2.3.8 雙親接合轉(zhuǎn)移方法及其優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
        2.3.9 類球紅細(xì)菌及其工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.10 類球紅細(xì)菌及其工程菌株類胡蘿卜素的提取與分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 雙親接合轉(zhuǎn)移最優(yōu)條件的選擇
        2.4.2 八氫番茄紅素四步脫氫酶CrtI_4的選擇
        2.4.3 替換質(zhì)粒pK18-△crtI_3::crtI_4的構(gòu)建
        2.4.4 深紅紅螺菌的crtI_4基因替換類球紅細(xì)菌自身的crtI_3基因
        2.4.5 敲除質(zhì)粒pK18-△crtC的構(gòu)建
        2.4.6 番茄紅素工程菌株RL1的篩選及鑒定
        2.4.7 番茄紅素工程菌株RL1發(fā)酵液中番茄紅素的定量分析
    2.5 本章小結(jié)
第3章 敲除中心代謝途徑關(guān)鍵基因zwf和整合表達(dá)MEP途徑限速基因dxs提高番茄紅素的產(chǎn)量
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌種、質(zhì)粒和引物
        3.2.2 分子實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒和酶類
    3.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.4.1 敲除質(zhì)粒pK18-△zwf質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.4.2 番茄紅素工程菌株RL2的篩選及鑒定
        3.4.3 替換質(zhì)粒pK18-△zwf::dxs的構(gòu)建
        3.4.4 番茄紅素工程菌株RL3的篩選及鑒定
        3.4.5 敲除zwf與整合表達(dá)dxs分別對(duì)番茄紅素合成的影響
    3.5 本章小結(jié)
第4章 番茄紅素工程菌株代謝機(jī)制及其發(fā)酵產(chǎn)物的定性
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 菌種、質(zhì)粒和引物
        4.2.2 分子實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒和酶類
        4.2.3 主要實(shí)驗(yàn)化學(xué)試劑
        4.2.4 主要儀器和設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法
        4.3.1 類球紅細(xì)菌總RNA的提取
        4.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        4.3.3 培養(yǎng)基中葡萄糖含量的檢測(cè)
        4.3.4 番茄紅素的純化結(jié)晶方法
        4.3.5 紅外光譜檢測(cè)方法
        4.3.6 核磁共振檢測(cè)方法
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 番茄紅素工程菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)番茄紅素含量的影響
        4.4.2 番茄紅素工程菌株RL3的發(fā)酵過(guò)程分析
        4.4.3 番茄紅素的分離純化
        4.4.4 紅外光譜測(cè)定結(jié)果
        4.4.5 核磁共振測(cè)定結(jié)果
    4.5 本章小結(jié)
第5章 類球紅細(xì)菌中β-胡蘿卜素生物合成途徑的初步構(gòu)建
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 菌種、質(zhì)粒和引物
        5.2.2 培養(yǎng)基及抗生素
    5.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法
        5.3.1 成團(tuán)泛菌的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取
        5.3.2 β-胡蘿卜素的定量分析
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 替換質(zhì)粒pK18-△crtI_3::crtY~(pa)I~(pa)的構(gòu)建
        5.4.2 利用成團(tuán)泛菌來(lái)源的crtI~(pa)Y~(pa)分別在RL1和RL3中構(gòu)建β-胡蘿卜素生物合成途徑
        5.4.3 β-胡蘿卜素工程菌株的HPLC定量分析
    5.5 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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[3]大腸桿菌萜類異源合成系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建[D]. 汪建峰.華東理工大學(xué) 2014
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碩士論文
[1]危害核桃的成團(tuán)泛菌及其系統(tǒng)進(jìn)化分析[D]. 趙耘霄.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]pucC超表達(dá)對(duì)Rhodobacter sphaeroides光合細(xì)菌表達(dá)體系異源蛋白表達(dá)水平的影響[D]. 程麗靜.重慶大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3173302