發(fā)布時(shí)間：2021-04-30 00:28

　　乳酸是自然界中應(yīng)用最為廣泛的天然有機(jī)酸,同時(shí)也是可降解高分子材料聚乳酸的前體物質(zhì)。近年來(lái),隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)意識(shí)日益增強(qiáng),極大地帶動(dòng)了聚乳酸行業(yè)的發(fā)展,進(jìn)而擴(kuò)大了市場(chǎng)對(duì)高質(zhì)量乳酸的需求。擬干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）作為一株潛在的工業(yè)乳酸生產(chǎn)菌,前期研究表明其具有高效的L-乳酸生產(chǎn)能力,但生成的產(chǎn)物中仍含有少量D-乳酸,從而使L-乳酸的光學(xué)純度達(dá)不到聚乳酸級(jí)別（>99.0%）。本研究通過(guò)建立擬干酪乳桿菌CRISPR/Cas9基因編輯平臺(tái),成功將高轉(zhuǎn)錄水平的ldhL1基因替換出發(fā)菌株中的ldhD基因,從而獲得一株高效生產(chǎn)高質(zhì)量L-乳酸的生產(chǎn)菌株,并對(duì)其在高糖濃度下發(fā)酵的生理代謝特性進(jìn)行初步分析。首先,對(duì)擬干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了適用于擬干酪乳桿菌的最佳轉(zhuǎn)化方法,使得轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到104（CFU/μg DNA）以上。通過(guò)RT-PCR對(duì)擬干酪乳桿菌中存在的三個(gè)乳酸脫氫酶基因（ldhL1、ldhL2和ldhD）進(jìn)行相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析,確定以高轉(zhuǎn)錄水平的ldhL1基因?yàn)楸硇突?構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),從而實(shí)現(xiàn)擬干酪乳桿菌的高... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 乳酸概述
        1.1.1 乳酸的性質(zhì)及生產(chǎn)
        1.1.2 聚乳酸的應(yīng)用
        1.1.3 乳酸的合成途徑
    1.2 乳酸菌概述
        1.2.1 乳酸菌生理功能
        1.2.2 乳酸生產(chǎn)菌介紹
    1.3 乳酸菌遺傳操作系統(tǒng)研究進(jìn)展
        1.3.1 基于質(zhì)粒的同源重組
        1.3.2 Red/RecET介導(dǎo)的DNA重組
    1.4 CRISPR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用
        1.4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理
        1.4.2 CRISPR技術(shù)拓展應(yīng)用
        1.4.3 Anti-CRISPRs蛋白的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用
    1.5 微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究
    1.6 課題研究意義及內(nèi)容
        1.6.1 研究意義
        1.6.2 研究?jī)?nèi)容
第2章 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 常用試劑
        2.1.4 常用培養(yǎng)基與試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大腸桿菌DH5α和擬干酪乳桿菌的培養(yǎng)和保藏
        2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.3 擬干酪乳桿菌感受態(tài)制備
        2.2.4 擬干酪乳桿菌抗性篩選標(biāo)記的選擇
        2.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.6 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.7 DNA的膠回收
        2.2.8 PCR片段的純化
        2.2.9 一步克隆連接
        2.2.10 擬干酪乳桿菌基因組DNA提取
        2.2.11 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA
        2.2.12 RT-PCR反應(yīng)
        2.2.13 發(fā)酵液中L/D-乳酸檢測(cè)
        2.2.14 菌體濃度測(cè)定
        2.2.15 發(fā)酵液殘余葡萄糖檢測(cè)
第3章 擬干酪乳桿菌CRISPR/Cas9基因編輯平臺(tái)的建立
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.4 實(shí)驗(yàn)引物
        3.2.5 ldhL1基因的sgRNA序列
        3.2.6 培養(yǎng)基
        3.2.7 L.paracasei電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化
        3.2.8 RT-PCR
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 L.paracasei電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化
        3.3.2 擬干酪乳桿菌ldhL1、ldhL2和ldhD基因轉(zhuǎn)錄情況分析
        3.3.3 ldhL1基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建
        3.3.4 ldhL1基因缺失突變株的獲得及搖瓶發(fā)酵特性分析
    3.4 本章小結(jié)
第4章 高質(zhì)量L-乳酸生產(chǎn)菌構(gòu)建
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種和質(zhì)粒
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
        4.2.3 培養(yǎng)基
        4.2.4 菌體的培養(yǎng)和保藏
        4.2.5 大腸桿菌DH5a感受態(tài)的制備及其熱擊轉(zhuǎn)化
        4.2.6 擬干酪乳桿菌(L.paracasei NCBIO01)電擊轉(zhuǎn)化
        4.2.7 實(shí)驗(yàn)引物
        4.2.8 融合PCR
        4.2.9 DNA膠回收方法
        4.2.10 PCR片段純化方法
        4.2.11 連接反應(yīng)
        4.2.12 細(xì)菌基因組DNA的提取
        4.2.13 ldhD基因的sgRNA序列
    4.3 研究結(jié)果
        4.3.1 環(huán)境條件對(duì)擬干酪乳桿菌乳酸光學(xué)純度的影響
        4.3.2 基于CRISPR/Cas9方法構(gòu)建pNcas-ΔldhD-ldhL1重組質(zhì)粒
        4.3.3 擬干酪乳桿菌D-乳酸脫氫酶缺失L-乳酸脫氫酶過(guò)表達(dá)重組菌獲得
        4.3.4 ldhL1過(guò)表達(dá)突變株搖瓶發(fā)酵特性分析
    4.8 本章小結(jié)
第5章 高性能擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸代謝特性分析
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 培養(yǎng)方法
        5.2.2 發(fā)酵副產(chǎn)物檢測(cè)
        5.2.3 建模方法和數(shù)據(jù)處理
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 5L發(fā)酵罐中l(wèi)dhL1過(guò)表達(dá)突變株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)和生產(chǎn)情況比較
        5.3.2 擬干酪乳桿菌發(fā)菌體生長(zhǎng)和乳酸生成動(dòng)力學(xué)模型建立
        5.3.3 高葡萄糖濃度下L-乳酸發(fā)酵代謝特性分析
    5.4 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
已發(fā)表或已錄用的論文(專利)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Anti-CRISPRs: The natural inhibitors for CRISPR-Cas systems[J]. Fei Zhang,Guoxu Song,Yong Tian.  Animal Models and Experimental Medicine. 2019(02)
[2]鼠李糖乳桿菌D-乳酸脫氫酶基因ldhD的敲除[J]. 許黎明,成春燕,呂軍.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(06)
[3]乳酸菌和少孢根霉菌發(fā)酵大豆加工休閑食品工藝優(yōu)化[J]. 崔蕊靜,劉素穩(wěn),康維民.  中國(guó)食品學(xué)報(bào). 2015(09)
[4]高通量選育高速率產(chǎn)L-乳酸擬干酪乳桿菌[J]. 王光耀,劉慧蘭,王永紅,儲(chǔ)炬,張嗣良.  食品工業(yè). 2013(10)



本文編號(hào)：3168479