發(fā)布時(shí)間：2021-04-28 11:53

　　茉莉酮酸是由脂肪酸衍生而來(lái)的環(huán)戊酮化合物,在農(nóng)業(yè)、香精香料、醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。目前植物中茉莉酮酸的合成途徑已較為清楚,但真菌中對(duì)茉莉酮酸合成的研究還局限于同位素示蹤法以及相關(guān)前體/代謝物質(zhì)的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到發(fā)酵產(chǎn)茉莉酮酸的伊朗二孢菌（Lasiodiplodia iranensis）,為提高其生產(chǎn)茉莉酮酸的產(chǎn)量,本文以L.iranensis為研究對(duì)象,通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物的GC-MS分析、基因組的測(cè)序分析、合成途徑關(guān)鍵酶的挖掘及其體外催化驗(yàn)證,初步確定10R-LOX（10R-lipoxygenase）是茉莉酮酸合成的關(guān)鍵酶;通過(guò)添加前體α-亞麻酸發(fā)酵,茉莉酮酸的產(chǎn)量可提高1倍以上。具體如下:（1）發(fā)酵液中茉莉酮酸類物質(zhì)的檢測(cè)。發(fā)酵液甲酯化后,利用GC-MS法檢測(cè),茉莉酮酸類物質(zhì)的最大占比為80.26%,其中茉莉酮酸為主要成分,最大占比為78.05%,其次為二氫茉莉酮酸,最大占比為2.21%,順式茉莉酮含量甚微,僅占0.17%。（2）L.iranensis基因組測(cè)序結(jié)果分析。利用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)L.iranensis進(jìn)行de novo測(cè)序,得到了43.01 ... 

【文章來(lái)源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 茉莉酮酸概況
        1.1.1 茉莉酮酸簡(jiǎn)介
        1.1.2 茉莉酮酸的用途
        1.1.3 茉莉酮酸的合成
    1.2 Lasiodiplodia概況
        1.2.1 Lasiodiplodia theobromae
        1.2.2 茉莉酮酸發(fā)酵概況
        1.2.3 茉莉酮酸合成途徑研究概況
        1.2.4 基因組研究概況
    1.3 論文的研究意義及研究?jī)?nèi)容
        1.3.1 研究意義
        1.3.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 培養(yǎng)方法
        2.2.2 發(fā)酵液的預(yù)處理
        2.2.3 GC-MS定量測(cè)定二氫茉莉酮酸方法性考察
        2.2.4 L.iranensis基因組DNA的提取與質(zhì)檢
        2.2.5 L.iranensis基因組文庫(kù)的構(gòu)建與質(zhì)檢
        2.2.6 L.iranensis基因組測(cè)序與數(shù)據(jù)分析
        2.2.7 候選基因的生物信息學(xué)分析
        2.2.8 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及熒光定量PCR(q RT-PCR)
        2.2.9 10R-LOX的表達(dá)及催化產(chǎn)物分析
        2.2.10 發(fā)酵過(guò)程中前體物質(zhì)的添加
        2.2.11 重復(fù)批次發(fā)酵
    2.3 分析方法
        2.3.1 蔗糖濃度的測(cè)定
        2.3.2 HPLC測(cè)定茉莉酮酸產(chǎn)量
        2.3.3 GC-MS測(cè)定發(fā)酵液中茉莉酮酸類物質(zhì)
        2.3.4 LC-MS測(cè)定10R-LOX催化產(chǎn)物
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 發(fā)酵液中茉莉酮酸類物質(zhì)的檢測(cè)分析
        3.1.1 GC-MS定性分析發(fā)酵液中相關(guān)成分
        3.1.2 GC-MS定量分析發(fā)酵液中二氫茉莉酮酸
    3.2 基因組測(cè)序結(jié)果分析
        3.2.1 基因組DNA的質(zhì)檢
        3.2.2 基因組文庫(kù)的構(gòu)建與質(zhì)檢
        3.2.3 基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的評(píng)估
        3.2.4 基因組序列的拼接
        3.2.5 基因的預(yù)測(cè)與功能注釋
        3.2.6 茉莉酮酸合成途徑相關(guān)基因的挖掘
    3.3 茉莉酮酸合成相關(guān)候選基因的生物信息學(xué)分析
        3.3.1 10R-LOX生物信息學(xué)分析
        3.3.2 ACX生物信息學(xué)分析
        3.3.3 KAT生物信息學(xué)分析
    3.4 茉莉酮酸生物合成相關(guān)基因的驗(yàn)證
        3.4.1 RT-PCR驗(yàn)證
        3.4.2 q RT-PCR分析
    3.5 10R-LOX的克隆表達(dá)及催化產(chǎn)物分析
        3.5.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.5.2 重組10R-LOX的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.5.3 重組10R-LOX催化反應(yīng)產(chǎn)物的分析
        3.5.4 10R-LOX結(jié)構(gòu)域保守基序的分析
    3.6 L.iranensis中茉莉酮酮酸的合成途徑
    3.7 L.iranensis茉莉酮酸發(fā)酵試驗(yàn)
        3.7.1 蔗糖的補(bǔ)加對(duì)茉莉酮酸產(chǎn)量的影響
        3.7.2 亞麻酸的添加對(duì)茉莉酮酸產(chǎn)量的影響
        3.7.3 重復(fù)批次發(fā)酵對(duì)茉莉酮酸產(chǎn)量的影響
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ:作者攻讀學(xué)術(shù)碩士期間發(fā)表的論文
附錄Ⅱ:10R-LOX密碼子優(yōu)化后編碼序列
附錄Ⅲ:10R-LOX氨基酸序列


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]芍藥種子中α-亞麻酸生物合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)[D]. 姜瑤.揚(yáng)州大學(xué) 2015
[3]龍眼焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 葉金巧.福建農(nóng)林大學(xué) 2009
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