腈水合酶（Nitrile hydratase,簡(jiǎn)稱NHase,EC 4.2.1.84）是一種能夠催化腈類化合物通過水合反應(yīng)生成酰胺類化合物的金屬酶,由α和β兩種亞基構(gòu)成。按照活性中心結(jié)合的金屬離子不同,可將NHase分為鐵型腈水合酶（Fe-NHase）和鈷型腈水合酶（Co-NHase）。NHase的生物合成需要一種激活蛋白的參與,其能輔助NHase攝取金屬離子及完成翻譯后修飾。根據(jù)前期研究,玫瑰色紅球菌Rhodococcus rhodochrous J1中低分子量型腈水合酶（L-NHase）的成熟過程遵循“亞基自身交換”機(jī)制,即:不含鈷離子的脫輔基酶apo-α₂β₂和含鈷離子的蛋白復(fù)合物holo-αe₂之間發(fā)生α亞基的交換,從而形成具有活性的全酶holo-α₂β₂。參與“亞基自身交換”過程的激活蛋白e與其它Co-NHase激活蛋白在Co-NHase的翻譯后成熟過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,但相關(guān)的研究較少,其作用機(jī)制尚未明確。本研究通過分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù),解析激活... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

腈類物質(zhì)代謝過程中的NHase[27]

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文4αCys115與βArg56之間的氫鍵對(duì)提供配體的2個(gè)半胱氨酸殘基起到穩(wěn)定作用，其中參與氫鍵形成的2個(gè)精氨酸殘基在所有NHase中保守。圖1-21AHJ的晶體結(jié)構(gòu)[42]β亞基和α亞基分別以黃色和藍(lán)色表示，紅色小球代表鐵離子Figure1-2Crystalstructureof1AHJShigehiroNagashima等在研究Rhodococcussp.N-771的Fe-NHase結(jié)構(gòu)（PDBID：2AHJ）時(shí)，通過傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry，F(xiàn)T-ICRMS）分析，發(fā)現(xiàn)活性中心保守基序中的第2個(gè)和第3個(gè)半胱氨酸殘基，經(jīng)過翻譯后修飾分別被氧化為半胱氨酸亞磺酸（Cys-SO2H）和半胱氨酸次磺酸（Cys-SOH）；并且發(fā)現(xiàn)失活狀態(tài)下Fe-NHase中的鐵離子與1個(gè)一氧化氮分子的氮原子配位（光照后一氧化氮分子被水分子取代從而激活Fe-NHase[43]），來自于αCys112-SO2H、αSer113和αCys114-SOH的3個(gè)氧原子構(gòu)成爪狀結(jié)構(gòu)（clawsetting），對(duì)活性中心結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用[44]。隨后，Co-NHase的晶體結(jié)構(gòu)也陸續(xù)得到解析，其來源有嗜熱假諾卡氏菌PseudonocardiathermophilaJCM3095（PDBID：1IRE）[45]、史氏芽胞桿菌BacillussmithiiSC-J05-1（PDBID：1V29）[46]和惡臭假單胞菌PseudomonasputidaNRRL-18668（PDBID：3QXE）[47]等。Co-NHase與Fe-NHase在α亞基和β亞基的一級(jí)序列上均具有保守區(qū)域，兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)同樣非常相似，但一些參與底物識(shí)別與結(jié)合的氨基酸殘基呈現(xiàn)差異，可能導(dǎo)致兩者具有不同的底物偏好性[45]。Co-NHase的活性中心結(jié)構(gòu)（圖1-3）也與Fe-NHase高度相似，與鈷離子配位的配體構(gòu)成八面體結(jié)構(gòu)，并且存在2個(gè)翻譯后修飾的半胱氨酸殘基和爪狀結(jié)構(gòu)，不同之處是鈷離子與1個(gè)水分子的氧原子配位，而不能與一氧化氮分子配位，這也是Co-NHase不具有光反應(yīng)性?

第一章緒論5圖1-3Co-NHase的活性中心結(jié)構(gòu)[50]粉色小球代表鈷離子，黑色小球代表碳原子，紅色小球代表氧原子，黃色小球代表硫原子，藍(lán)色小球代表氮原子，配體與鈷離子的配位作用以黑色點(diǎn)線表示，氧化修飾的半胱氨酸殘基與2個(gè)精氨酸殘基形成的鹽橋以紅色點(diǎn)線表示Figure1-3StructureofCo-NHaseactivecenter1.2.4腈水合酶激活蛋白在NHase的研究過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)，不論對(duì)于Fe-NHase還是Co-NHase，僅僅有β亞基、α亞基和金屬離子的參與，不能形成具有正�；钚缘某墒烀竅50,51]。生物體內(nèi)與NHase相關(guān)的基因簇中，往往存在多個(gè)行使調(diào)控功能的基因，其中在編碼β亞基和α亞基的結(jié)構(gòu)基因下游存在一種編碼NHase激活蛋白的基因，該類蛋白能夠輔助NHase的成熟[20,52-54]。周哲敏等在研究來源于R.rhodochrousJ1的低分子量型腈水合酶（L-NHase）時(shí)，發(fā)現(xiàn)L-NHase攝取鈷離子和活性表達(dá)依賴于一種激活蛋白e的協(xié)助，并基于此提出了一種全新的金屬酶生物合成機(jī)制——亞基自身交換機(jī)制[50,55]（“self-subunitswapping”mechanism，圖1-4）。該機(jī)制認(rèn)為，β亞基和不含鈷離子、半胱氨酸殘基未被氧化修飾的α亞基結(jié)合形成脫輔基酶apo-α2β2；同時(shí)激活蛋白e輔助α亞基攝取鈷離子，完成半胱氨酸殘基的氧化修飾，形成蛋白復(fù)合物holo-αe2；在apo-α2β2中β亞基的2個(gè)保守精氨酸殘基與holo-αe2中α亞基的2個(gè)氧化修飾的半胱氨酸殘基之間的靜電引力驅(qū)動(dòng)下，兩者的α亞基發(fā)生互換，形成全酶holo-α2β2和蛋白復(fù)合物apo-αe2；apo-αe2可繼續(xù)攝取鈷離子，進(jìn)行下一輪亞基自身交換。激活蛋白e在該過程中發(fā)揮了亞基自身交換伴侶蛋白的功能。這種機(jī)制在Co-NHase中具有一定的普遍性，劉義等證明了P.putidaNRRL-18668來源的Co-NHase同樣遵循亞基自身交換機(jī)制[56

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]同步輻射光源及其特點(diǎn)[J]. 畢拉力·木乎提江,阿力甫江·扎依提.  新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2015(04)
[2]Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大腸桿菌中的表達(dá)策略[J]. 余越春,崔文璟,劉義,周哲敏.  工業(yè)微生物. 2014(02)
[3]蛋白質(zhì)晶體的物理性質(zhì)及其鑒別方法研究進(jìn)展[J]. 解旭卓,曹慧玲,鹿芹芹,陳瑞卿,郭云珠,周伯儒,尹大川.  生物技術(shù)通訊. 2013(01)
[4]蛋白質(zhì)結(jié)晶方法的研究進(jìn)展[J]. 劉四化,王倩倩,肖良,張黎明.  中國生化藥物雜志. 2011(05)
[5]煙酸和煙酰胺的合成和應(yīng)用[J]. 徐兆瑜.  精細(xì)化工原料及中間體. 2003(09)
[6]丙烯酰胺及其聚合物的生產(chǎn)技術(shù)及應(yīng)用[J]. 吳曉云,顧文杰.  現(xiàn)代化工. 2002(S1)
[7]金屬離子對(duì)酶功能所起的作用[J]. 王健.  宜賓師專學(xué)報(bào). 1993(02)



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