甘露糖-6-磷酸（M6P）涉及生命中的許多代謝途徑,在疾病治療中具有重要的應(yīng)用。本論文的主要研究內(nèi)容是開發(fā)一種合成甘露糖-6-磷酸的新方法,創(chuàng)造了一種利用多磷酸鹽依賴型甘露糖激酶合成甘露糖-6-磷酸的酶催化合成方法。本論文的合成方式相比于化學(xué)合成法更加安全、更加綠色,且替代了傳統(tǒng)且昂貴的磷酸鹽供體:ATP。論文的主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面:基因工程菌的構(gòu)建、單因素變量對甘露糖-6-磷酸合成的影響、響應(yīng)面法優(yōu)化合成反應(yīng)、工藝的中試放大等幾個方面,具體工作與研究結(jié)果如下:（1）該課題成功構(gòu)建了異源表達載體,克隆了來自節(jié)桿菌（Arthrobactersp）KM菌株的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶（PPGMK）基因,在大腸桿菌中實現(xiàn)了多聚磷酸鹽依賴型激酶的異源表達,命名為L7,成功實現(xiàn)了體外合成甘露糖-6-磷酸。（2）利用單因素實驗探究各種條件對于轉(zhuǎn)化率的影響,對合成反應(yīng)進行初步的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)溫度在30℃、Mg2+濃度>10 mM、甘露糖添加量在2%、六偏磷酸鈉添加量為20 g/L時,酶催化反應(yīng)具有較高的轉(zhuǎn)化率。同時發(fā)現(xiàn)Mg2+與Mn2+是比較適合的作為輔因子,六偏磷酸鈉與ATP 比較適合作... 

【文章來源】：北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１甘露糖－６－磷酸??Ｆｉｇ．１－１?Ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ??

?北京化工大學(xué)碩士論文???Ｉ??圖２－２?Ｌ７誘導(dǎo)表達蛋白電泳??１和２：?Ｌ７粗酶液，Ｍ：標(biāo)準(zhǔn)蛋白??Ｆｉｇ．?２－２?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｐＥＴ２８ａ－／７??１?ａｎｄ?２：?Ｌ７?ｃｒｕｄｅ?ｅｎｚｙｍｅ，?Ｍ：?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ??２．４．３薄層結(jié)果驗證??薄層層析法體系選擇異丙醇、水和冰醋酸做為展開劑，可以對甘露糖－６－磷酸??和甘露糖進行分離，并定性檢測。如圖２－３所示，ｌａｎｅｌ和ｌａｎｅ２分別表示的是甘??露糖標(biāo)品和甘露糖－６－磷酸標(biāo)品的條帶。從圖中可以看到通過展開劑一定時間的??作用后，甘露糖與Ｍ６Ｐ隨著展開劑自下而上展開，在靠近硅膠板頂端，是甘露??糖條帶，這與甘露糖的極性比甘露糖－６－磷酸更大有關(guān)。ｌａｎｅ３表示的是反應(yīng)液條??帶，通過與ｌａｎｅｌ與ｌａｎｅ２比對發(fā)現(xiàn)，有甘露糖－６－磷酸生成，同時底物甘露糖并??沒有消耗完全，留有條帶。說明在２．３．５的反應(yīng)體系下，反應(yīng)時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率并沒??有達到１００％。薄層層析實驗證明了?Ｌ７酶異源表達成功，并且擁有生物催化活??性。??２０??

?第二章？基因工程菌的構(gòu)建???ｒｍ??Ｍａｎｎｏｓｅ??ｃ｜??■?Ｍ６Ｆ?■??ＬＩ??圖２－３?Ｌ７薄層層析結(jié)果??１：甘露糖標(biāo)品，２：甘露糖－６－磷酸標(biāo)品，３：反應(yīng)液??Ｆｉｇ．?２－３?ＴＬＣ?ｏｆ?ｐＥＴ２８ａ－／７??１：?ｍａｎｎｏｓｅ?ｍａｒｋｅｒ，?２：?ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｍａｒｋｅｒ，?３：?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｌｉｑｕｉｄ??２．４．４核磁結(jié)果驗證??在核磁共振儀中，氫原子的躍遷信號可以被記錄，由于不同位置的氫原子產(chǎn)??生的共振頻率不同，在光譜上就具有不同的位置。就可以利用峰面積和化學(xué)位移??等信息幫助推斷其在化合物中的位置。如圖２－４所示，圖為酶反應(yīng)后產(chǎn)物的圖譜，??首先，峰的數(shù)目可以表示該產(chǎn)物的氫原子種類；而峰面積可以表示該產(chǎn)物中氫原??子的相對數(shù)目。通過比對后發(fā)現(xiàn)，甘露糖－６－磷酸的氫原子信息與譜圖一一對應(yīng)，??該方法從另一個角度說明了?Ｌ７酶具有生物催化活性，產(chǎn)物是甘露糖－６－磷酸。??２１??

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3064695