本實驗以核黃素工程菌B.subtilis 120和B.subtilis X42為出發(fā)菌,通過基因組重排技術獲得核黃素工程菌B.subtilis 1-1,隨后經(jīng)過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實現(xiàn)核黃素產(chǎn)量提升。在5L-發(fā)酵罐放大培養(yǎng)中,通過優(yōu)化發(fā)酵工藝和培養(yǎng)基組成實現(xiàn)了核黃素產(chǎn)量的進一步提升,在120h的發(fā)酵周期內(nèi),菌株B.subtilis 1-1核黃素產(chǎn)量達到18.5 g/L,核黃素得率為0.119 g/g葡萄糖。本實驗還以B.subtilis 120spc為出發(fā)菌,過表達異源β-1,4-木聚糖內(nèi)切酶和β-木糖甘酶,以及異源木糖利用相關酶,實現(xiàn)了菌株高效利用木聚糖生產(chǎn)核黃素。首先對B.subtilis X42進行復壯,并將其作為親株一。往B.subtilis 120染色體中引入spc基因用以作為原生質(zhì)體融合篩選標記,獲得的工程菌B.subtilis120spc為親株二。利用基因組重排技術將兩株親株進行重排,通過篩選獲得核黃素高產(chǎn)融合子B.subtilis 1-1。該菌株搖瓶核黃素產(chǎn)量可達7443.66±102.54 mg/L,核黃素得率可達93.87±1.00 mg/g葡萄糖,與親株B.subt... 

【文章來源】：天津大學天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

核黃素結構式

圖 1-2 枯草芽孢桿菌核黃素合成途徑Fig. 1-2 Biosynthetic pathway of riboflavin in B.subtilis 核黃素操縱子草芽孢桿菌核黃素操縱子長約 4.3kb，其結構如圖 1-3 所示，共包按照排列順序分別為 ribG、ribB、ribA、ribH 和 ribT，這些基因與徑緊密相關。其中，ribG 用于表達嘧啶還原酶和嘧啶脫氨酶，P 的脫氨反應和 ARPP 的還原反應；ribB 可以表達核黃素合成酶，催黃素；ribA 表達 GTP 環(huán)水解酶和 DHBP 合成酶；ribH 表達二氧四；ribT 基因功能尚不清楚，但 Perkins 等[27]發(fā)現(xiàn) ribT 的缺失可以在弱玫瑰黃素突變株核黃素合成能力，由此可推測其與核黃素合成具。核黃素操縱子內(nèi)部基因由一個一級啟動子 P1和兩個二級啟動子P1與 P2受細胞內(nèi)核黃素水平調(diào)控，過高的濃度將會削弱啟動子表

圖 1-3 枯草芽孢桿菌核黃素操縱子結構Fig. 1-3 The structure of the rib operon in B.subtilis除上述核黃素操縱子包含的 5 個基因以外，枯草芽孢桿菌還存在其他一些基因與核黃素合成緊密相關，主要有 ribC、ribR 和 yapA 等。ribC 基因能夠表達核黃素激酶和 FAD 合成酶，這兩種酶可以催化核黃素生成 FMN 和 FAD[35,36]；ribR 可以表達核黃素激酶，與 ribC 基因表達的核黃素激酶是同工酶，用于催化 FMN 的合成；而 yapA 則表達核黃素運輸?shù)鞍祝ＷC細胞內(nèi)不過量積累核黃素[37, 38]。1.3.3 枯草芽孢桿菌核黃素高產(chǎn)菌株構建策略枯草芽孢桿菌是核黃素工業(yè)生產(chǎn)的重要菌株，常見的高產(chǎn)核黃素生產(chǎn)菌株構建有以下三個策略：1）通過誘變育種篩選獲得核黃素高產(chǎn)菌株；2）通過提高枯草芽孢桿菌中核黃素操縱子表達水平提高菌株核黃素積累能力；3）通過提高核

【參考文獻】：
期刊論文
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[1]基于比較基因組學和轉(zhuǎn)錄組學的枯草芽孢桿菌過量積累核黃素遺傳機理研究[D]. 王光路.天津大學 2014
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碩士論文
[1]產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的代謝工程研究[D]. 王永成.天津大學 2015
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本文編號：3055126