乳糖酶又稱β-D半乳糖苷酶,可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用。乳糖酶作為一種生物酶制劑,在醫(yī)藥上主要用來治療乳糖不耐受癥;在食品工業(yè)上主要添加在乳制品中制成低乳糖奶制品。針對目前乳糖酶工業(yè)化中生產(chǎn)存在的問題,如產(chǎn)酶量低、胞內(nèi)分泌,回收率低等,結(jié)合現(xiàn)代基因工程技術(shù),選取米曲霉乳糖酶為目的基因,乳酸克魯維酵母GG799為宿主細胞,重組構(gòu)建一株可胞外分泌、酶學(xué)性質(zhì)好、表達水平高的新型產(chǎn)乳糖酶工程菌株。根據(jù)乳酸克魯維酵母密碼子的偏愛性,在不改變原氨基酸序列的前提下,以米曲霉乳糖酶基因為模板,對米曲霉乳糖酶基因序列人工合成并進行優(yōu)化。優(yōu)化后的乳糖酶基因lacA序列全長2982 bp,GC含量由原來的51.4%降低到39.2%,共改變了基因序列中的678個基因位點,高頻密碼子大幅度增加。將優(yōu)化后的乳糖酶基因序列l(wèi)acA連接至pKLAC1載體的XhoⅠ/BglⅡ位點之間構(gòu)建載體pKLAC1-lacA,用電脈沖法將經(jīng)SacⅡ線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母GG799中,酵母基本碳源培養(yǎng)基YCB富集得到大量轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過多次電轉(zhuǎn),篩選出一株可高效分泌表達乳糖酶的重組酵母工程菌株l... 

【文章來源】：南陽師范學(xué)院河南省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

乳糖酶的水解反應(yīng)圖

條件下酶活力保持時間較長，低溫保存 30 d 酶活性仍5]。但原始米曲霉菌株所產(chǎn)的乳糖酶酶活性都較低，歐分泌的乳糖酶進行研究，培養(yǎng)基優(yōu)化后測得乳糖酶的活力較低。本研究結(jié)合基因工程技術(shù)，以乳酸克魯維酵乳糖酶基因，并根據(jù)乳酸克魯維酵母密碼子的偏愛性乳糖酶基因序列構(gòu)建到載體 pKLAC1 中，將重組載母中，進行平板篩選、PCR 驗證、SDS-PAGE 電泳分株可高效表達乳糖酶的重組菌株。達載體799 由本實驗室保存，載體 pKLAC1 圖譜如圖 2-1 所

2-3 The absorbance values of different concentration of ONP at苯酚的濃度為縱坐標，稀釋液在 420 nm 處吸光值為橫坐線，結(jié)果如圖 2-2 所示。序號 濃度（mmol/L） A4201234567800.020.040.060.080.100.120.1400.0880.1770.2670.3530.4410.5270.601

【參考文獻】：
期刊論文
[1]嬰兒乳糖不耐受病因研究及防治進展[J]. 俞棟,葉環(huán).  預(yù)防醫(yī)學(xué). 2018(08)
[2]一株嗜熱鏈球菌乳糖酶的分離純化及酶學(xué)特性研究[J]. 曹永強,余志堅,陳超,張健,楊貞耐.  食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報. 2018(02)
[3]兒童乳糖不耐受癥的診斷與治療進展[J]. 陶東亞,蘇述平.  現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生. 2018(06)
[4]駱駝凝乳酶原基因在乳酸克魯維酵母中的重組表達[J]. 徐龍龍,劉思彤,任永成,惠豐立.  中國食品學(xué)報. 2017(12)
[5]微生物乳糖酶研究進展[J]. 賀璐,龍承星,劉又嘉,惠華英,譚周進.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2017(06)
[6]乳糖酶的固定化及其應(yīng)用研究進展[J]. 李晶,王存芳.  乳業(yè)科學(xué)與技術(shù). 2016(06)
[7]乳糖酶活性檢測方法研究進展[J]. 惠華英,黃鶯,雷志丹,張曉青,譚周進.  中國微生態(tài)學(xué)雜志. 2016(09)
[8]響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 趙從波,章淑艷,羅同陽,李賓.  中國乳品工業(yè). 2014(04)
[9]乳酸克魯維酵母的發(fā)酵優(yōu)勢及在食品酶制劑領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 王玉海,張慧斌,楊慧敏,孟青青,王鳳寰.  中國生物工程雜志. 2013(12)
[10]腸道乳糖酶的研究進展[J]. 譚周進,郭抗蕭,曾奧,郭照輝,王歡.  世界華人消化雜志. 2013(28)

博士論文
[1]乳酸克魯維酵母表達異源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌機制研究[D]. 連昭.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]產(chǎn)乳糖酶酵母菌株的遺傳改良和乳糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)[D]. 徐金利.中國海洋大學(xué) 2012

碩士論文
[1]基因工程技術(shù)生產(chǎn)乳糖酶的研究[D]. 張霞.北京化工大學(xué) 2015
[2]米曲霉乳糖酶的發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D]. 山琳.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]馬克斯克魯維酵母菌乳糖酶基因的高效表達和高活力乳糖酶的生產(chǎn)[D]. 畢海洋.中國海洋大學(xué) 2014
[4]凝結(jié)芽孢桿菌耐熱乳糖酶基因的原核表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 吳瓊.大連工業(yè)大學(xué) 2012
[5]米曲霉生產(chǎn)乳糖酶的研究[D]. 歐軍.東北林業(yè)大學(xué) 2008
[6]黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達[D]. 李淑娟.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號：3052967