發(fā)布時間：2021-02-24 05:50

　　纖維素是地球上豐富的可再生資源,其發(fā)酵生產(chǎn)的生物質(zhì)燃料對解決目前能源問題具有十分重要意義。然而纖維素酶水解效率較低,極大地限制了纖維素在酶解發(fā)酵方面的高效應(yīng)用。近年許多研究發(fā)現(xiàn),溶解性多糖單加氧酶家族Auxiliary Activity 9（AA9）對纖維素的水解具有明顯促進作用,這為AA9作為纖維素酶輔助酶用于纖維素高效水解提供了一種可能�；诖�,本文嘗試開展輔助酶AA9的構(gòu)建表達和應(yīng)用于纖維素水解的研究,主要研究內(nèi)容如下:論文首先通過密碼子優(yōu)化和抗性篩選,獲得兩株異源表達AA9的單質(zhì)粒重組畢赤酵母菌株P(guān).pastoris/pPIC9K-gh61和P.pastoris/pPICZαA-gh61;通過進一步優(yōu)化,獲得雙質(zhì)粒整合重組菌株P(guān).pastoris GS115-D-gh61,其表達量提高20%。實驗考察AA9的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為60℃,最適反應(yīng)pH 6.0,5 mmol.L^-1的Co²⁺、Ba²⁺和Cu²⁺對酶活促進作用最明顯（分別提高39%、51%和19%）。接著,實驗分別對三株重... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

纖維素結(jié)構(gòu)以及氫鍵網(wǎng)絡(luò)示意圖

圖 1-2AA9 蛋白結(jié)構(gòu)以及反應(yīng)過程(a) AA9 蛋白結(jié)構(gòu) (b) AA9 催化反應(yīng)過程Fig.1-2 The protein structure of AA9 and reaction mechanism.(a) The protein structure of AA9 (b) The catalytic reaction mechanism of AA9根據(jù) AA9 氧化酶切纖維素不同位置碳鍵，Moses 將 AA9 分為 3 類，分別為 PMO1(Polysaccharide monooxygenase 1) 、PMO2 (Polysaccharide monooxygenase 2) 和 PMO3(Polysaccharide monooxygenase 3)[20]。如圖 1-3 所示，PMO1 切斷吡喃糖殘基 C1 鍵，形成不穩(wěn)定的 1,5- -內(nèi)酯且在水中會被分解成醛糖酸；PMO2 切斷吡喃糖殘基 C4 鍵生成4-酮醛糖，生成的產(chǎn)物在水溶液中以相應(yīng)水合物形式存在，而且氧化后形成的低聚糖容易在堿性條件下發(fā)生異構(gòu)化[21-23]；PMO3 非特異性生成醛糖酸內(nèi)酯或者 4-酮醛糖。AA9活性中心表面分布著裸露的芳香族氨基酸殘基，研究者通過比較芳香族氨基酸殘基含量發(fā)現(xiàn) PMO1 蛋白結(jié)構(gòu)域中芳香族氨基酸殘基含量最多，PMO2 含量最少。芳香族氨基酸殘基被認為是 AA9 與纖維素相互作用的至關(guān)重要結(jié)構(gòu)，因此芳香族氨基酸含量差異也是造成它們活性差異較大的主要原因之一。

圖 1-2AA9 蛋白結(jié)構(gòu)以及反應(yīng)過程(a) AA9 蛋白結(jié)構(gòu) (b) AA9 催化反應(yīng)過程Fig.1-2 The protein structure of AA9 and reaction mechanism.(a) The protein structure of AA9 (b) The catalytic reaction mechanism of AA9 AA9 氧化酶切纖維素不同位置碳鍵，Moses 將 AA9 分為 3 類，分別為haride monooxygenase 1) 、PMO2 (Polysaccharide monooxygenase 2) 和 haride monooxygenase 3)[20]。如圖 1-3 所示，PMO1 切斷吡喃糖殘基 C1 的 1,5- -內(nèi)酯且在水中會被分解成醛糖酸；PMO2 切斷吡喃糖殘基 C4 鍵，生成的產(chǎn)物在水溶液中以相應(yīng)水合物形式存在，而且氧化后形成的低聚條件下發(fā)生異構(gòu)化[21-23]；PMO3 非特異性生成醛糖酸內(nèi)酯或者 4-酮醛糖表面分布著裸露的芳香族氨基酸殘基，研究者通過比較芳香族氨基酸殘基O1 蛋白結(jié)構(gòu)域中芳香族氨基酸殘基含量最多，PMO2 含量最少。芳香族氨為是 AA9 與纖維素相互作用的至關(guān)重要結(jié)構(gòu)，因此芳香族氨基酸含量差們活性差異較大的主要原因之一。

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]里氏木霉Cel5A和Cel6A的畢赤酵母異源表達[D]. 白仁惠.江南大學(xué) 2016
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本文編號：3048893