生長偶聯(lián)型啟動子具有在對數(shù)期高強(qiáng)度表達(dá),進(jìn)入穩(wěn)定期后停止表達(dá)的特點。本研究以生長偶聯(lián)型啟動子和降解標(biāo)簽組建動態(tài)下調(diào)開關(guān),以生長偶聯(lián)型啟動子（GPP）、阻遏蛋白、降解標(biāo)簽（ssrA）為基礎(chǔ)構(gòu)建動態(tài)上調(diào)開關(guān),在成功構(gòu)建動態(tài)上調(diào)開關(guān)和動態(tài)下調(diào)開關(guān)的基礎(chǔ)上,將兩種開關(guān)合并,以正交的方式分別對兩種目的蛋白同時實現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)。莽草酸是大腸桿菌合成芳香族氨基酸的中間代謝物,也是抗流感藥物“達(dá)菲”的重要前體。葡萄糖二酸是合成多種高效環(huán)保的新興生物質(zhì)能源的原料,具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)價值。而莽草酸和葡萄糖二酸在生物合成中,面臨著合成路徑與細(xì)胞生長競爭前體物質(zhì)的問題。因此本研究使用分子開關(guān)將細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成解偶聯(lián),實現(xiàn)碳代謝流的自主分配。然后應(yīng)用到大腸桿菌的內(nèi)源代謝路徑中生產(chǎn)莽草酸,和外源代謝路徑中生產(chǎn)葡萄糖二酸。主要結(jié)果如下所示:1.首先構(gòu)建生長偶聯(lián)型啟動子文庫,以啟動子相對活性的峰值為評測標(biāo)準(zhǔn),最終選擇不同強(qiáng)度的啟動子rpsL、rpsT P1、rpsA P1、rrnA P1和rrnC P1用于分子開關(guān)的組建。構(gòu)建由ssrA降解標(biāo)簽組成的文庫,以降解速率為降解標(biāo)簽的評測標(biāo)準(zhǔn),選擇不同強(qiáng)度的降解標(biāo)簽LAA、... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

莽草酸和奧司他韋結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Thestructuralformulaofshikimicacidandoseltamivir

第一章緒論21.1.3莽草酸的代謝工程策略目前，通過發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸可滿足當(dāng)前約30%的需求。莽草酸途徑如圖1-2所示，該代謝途徑用于合成生長必需的芳香族氨基酸。莽草酸途徑以磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤蘚糖-4-磷酸(E4P)作為前體物質(zhì)，PEP通過糖酵解途徑產(chǎn)生，而戊糖磷酸途徑用于產(chǎn)生E4P。莽草酸途徑依賴于糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑來提供其所需的兩種前體，僅進(jìn)行單一的代謝工程改造可能不足以增加莽草酸的產(chǎn)量。通過糖酵解和戊糖磷酸途徑產(chǎn)生的E4P和PEP，將通過DAHP合酶的作用在莽草酸途徑中縮合，從而產(chǎn)生3-脫氧-D-阿拉伯糖庚酸7-磷酸(DAHP)。DAHP合酶分別由aroF，aroG，aroH編碼，分別接受來自三種芳族氨基酸即L-酪氨酸，L-苯丙氨酸和L-色氨酸的反饋抑制。然后，3-脫氫奎尼酸合酶(DHQ合酶，aroB編碼)將DAHP轉(zhuǎn)化為3-脫氫奎尼酸(DHQ)，3-脫氫奎尼酸脫水酶(DHQ脫水酶，aroD編碼)通過脫水作用將DHQ轉(zhuǎn)化為3-脫氫莽草酸(DHS)，然后在莽草酸脫氫酶(aroE編碼)的作用下將轉(zhuǎn)化為莽草酸。莽草酸激酶(aroL和aroK編碼同工酶)負(fù)責(zé)將莽草酸轉(zhuǎn)化為莽草酸-3-磷酸。鳥苷酸是莽草酸途徑的最終產(chǎn)物，該化合物是其他芳香族產(chǎn)物(例如芳香族氨基酸)生物合成的常見前體[17]。大腸桿菌莽草酸途徑的限速酶是DAHP合酶、DHQ合酶和莽草酸激酶。圖1-2莽草酸途徑示意圖Fig.1-2Schematicdiagramoftheshikimicacidpathway注：aroG，編碼DAHP合酶；aroD，編碼DHQ脫水酶；aroE，編碼莽草酸脫氫酶；aroK/aroL，編碼莽草酸激酶I/II；PYR，丙酮酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；E4P，4-磷酸赤蘚糖；DAHP，3-脫氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸；DHQ，3-脫氫奎寧酸；DHS，3-脫氫莽草酸；SA，莽草酸；S3P，莽草酸-3-磷酸；CHA，分支酸。Draths和Krmer等人通過代謝工程手段對?

第一章緒論4圖1-3葡萄糖二酸結(jié)構(gòu)式Fig.1-3Thestructuralformulaofglucaricacid1.2.2葡萄糖二酸的化學(xué)合成策略葡萄糖二酸是具有四個手性碳的高度官能化的化合物，可以通過葡萄糖的化學(xué)氧化合成[35]。由葡萄糖制備葡萄糖二酸的方法是將末端的醛基和伯羥基氧化為羧基，而其它的4個羥基不變[36]�，F(xiàn)有的葡萄糖二酸制備方法主要為化學(xué)法如硝酸氧化和以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)為催化劑的合成方法。使用硝酸氧化法催化葡萄糖合成葡萄糖二酸在上世紀(jì)就已被提出，因為硝酸既可作為溶劑又可作為氧化劑，且操作簡單，因此該方法至今仍具有商業(yè)吸引力。但是葡萄糖二酸的得率僅為40%-45%。Tyler等人使用計算機(jī)控制的反應(yīng)器，通過在封閉的反應(yīng)器中調(diào)整為氧氣正壓條件，將D-葡萄糖和硝酸受控氧化為葡萄糖二酸，并提出一種將無機(jī)硝酸鹽從有機(jī)氧化產(chǎn)物中分離出來的納濾方法，將硝酸直接從有機(jī)氧化產(chǎn)物中分離[37]。2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)一種亞硝酰自由基，Mathias等報道了一種使用TEMPO/NaBr/NaOCl和TEMPO/NaBr/Cl2系統(tǒng)的新型葡萄糖二酸合成方法，以Thaburet等人的工作為基礎(chǔ)開發(fā)一種電化學(xué)氧化方法用來減少合成葡萄糖二酸時產(chǎn)生不必要的副產(chǎn)物。最終通過優(yōu)化氧化參數(shù)，例如催化劑量、pH、溫度和陽極類型，葡萄糖二酸的得率可以超過85%[38]。1.2.3葡萄糖二酸的代謝工程策略因為化學(xué)合成葡萄糖二酸存在著催化劑昂貴，反應(yīng)條件苛刻和轉(zhuǎn)化率低等問題，使用微生物細(xì)胞工廠發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸成為潛在的解決方案。在自然界中，哺乳動物體內(nèi)存在天然的葡萄糖二酸合成途徑。葡萄糖醛酸途徑會在體內(nèi)產(chǎn)生D-葡萄糖二酸和L-抗壞血酸。該途徑是以D-半乳糖或D-葡萄糖為底物并與戊糖磷酸途徑相互作用。但是，這是一條漫長的途徑，由十多個轉(zhuǎn)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]代謝工程改造畢赤酵母生產(chǎn)葡萄糖二酸[J]. 劉葉,鞏旭,康振,堵國成,陳堅,華兆哲.  食品與生物技術(shù)學(xué)報. 2018(09)
[2]代謝改造釀酒酵母生產(chǎn)葡萄糖二酸[J]. 陳娜,林盧奇,毛銀,趙運英,鄧禹.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2018(12)
[3]構(gòu)建葡萄糖二酸指示系統(tǒng)篩選肌醇加氧酶突變株[J]. 王毳,劉葉,鞏旭,劉龍,康振.  生物工程學(xué)報. 2018(11)
[4]代謝工程改造釀酒酵母合成葡萄糖二酸[J]. 鞏旭,劉葉,王毳,李江華,康振.  生物工程學(xué)報. 2017(02)
[5]大腸桿菌aroL基因敲除及其對莽草酸合成的影響[J]. 付小花,高益范,郝思捷,張伯生,任大明.  復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版). 2007(03)

博士論文
[1]合成生物學(xué)技術(shù)改造大腸桿菌生產(chǎn)莽草酸及白藜蘆醇[D]. 劉向磊.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 2016

碩士論文
[1]大腸桿菌利用蔗糖高效合成D-葡萄糖二酸的研究[D]. 曲亞楠.北京化工大學(xué) 2018
[2]大腸桿菌過量合成莽草酸的代謝工程[D]. 李明明.江南大學(xué) 2013



本文編號：3045870