重組SipoEXLX2增效蛋白的表達、純化及特性研究
發(fā)布時間：2021-01-12 03:25
作為地球最豐富的生物質(zhì)能源,木質(zhì)纖維素可經(jīng)纖維素酶降解為葡萄糖進而轉(zhuǎn)化為生物乙醇等燃料,但由于木質(zhì)纖維素高度復(fù)雜的結(jié)晶結(jié)構(gòu)致使木質(zhì)纖維素的酶解受到了阻礙。纖維素酶增效蛋白作為一種非水解性蛋白,已被認為是提高纖維素酶水解效率,減少酶載量的選擇。本實驗室克隆構(gòu)建了一株來源于甘薯鏈霉菌的含增效蛋白基因的重組菌,SipoEXLX2為增效蛋白基因的表達產(chǎn)物。在前期純化中未能得到單一條帶的SipoEXLX2目的蛋白。因此,本文開展了SipoEXLX2增效蛋白的表達純化、作用機理和協(xié)同纖維素酶降解堿處理水稻秸稈等工作,實驗結(jié)果如下:通過重新構(gòu)建質(zhì)粒載體,在C-末端增加His標簽,純化得到了純度大于90%,協(xié)同增效大于1倍的SipoEXLX2增效蛋白。經(jīng)過誘導(dǎo)條件優(yōu)化,SipoEXLX2蛋白在IPTG為1M,16℃誘導(dǎo)12h的條件下,目的蛋白上清中的表達量達到約35 mg/L。SipoEXLX2增效蛋白協(xié)同纖維素酶降解濾紙的影響因素和作用機理研究。SipoEXLX2增效蛋白協(xié)同纖維素酶的最佳協(xié)同條件是pH 4.8、溫度50℃、250μg SipoEXLX2增效蛋白和0.06 FPU/g cellulo...
【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校
【文章頁數(shù)】：75 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖２－１重組質(zhì)粒的圖譜??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇａｍ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??
?（ｃ）重組質(zhì)粒??載體圖譜如圖２－１：與原重組質(zhì)粒不同的是在ＰＥＴ２８ａ質(zhì)粒的Ｃ－末端增加了一個Ｈｉｓ??標簽。提取原Ｓｉｐｏｌ－ｐＥＴ２８ａ⑴－Ｅ．ｃｏｌｉ重組菌的ＤＮＡ，ＰＣＲ擴增，回收擴增序列，通過??ＢａｍＨＩ和Ｘｈｏｌ對原始載體ｐＥＴ２８ａ和ＰＣＲ產(chǎn)物進行酶切，將獲得的片段和載體通過Ｔ４??連接酶連接到載體骨架上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ＤＨ５?ａ中。挑取陽性單克隆測序。??（２ＳＳ?．．?１８２｝?Ｒ?ＸｈＯｌ?；１Ｓ８｝??：??０＾１?｛８３６｝??７ｔａｇ（ｇｃｍｉｉ〇ｔｅａｄ？：｝??ｓｉｔｅ??圖２－１重組質(zhì)粒的圖譜??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇａｍ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??（ｄ）蛋白表達??１）將測序正確的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入ＢＬ２１?（Ｒｉｌ）（全式金）。??２）?挑取單克隆搖菌３７°Ｃ?２２０ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)８￣１２ｈ。將單克隆進行ＰＣＲ鑒定，并將鑒??定正確的菌液按照１％的接種量轉(zhuǎn)接至１５０ｍＬＬＢ培養(yǎng)基中３７°Ｃ繼續(xù)培養(yǎng)表達。??１８??
圖２＿３葡萄糖標準曲線圖??Ｆｉｇ．?２－３?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｇｌｕｃｏｓｅ??圖２－３所示可知，ｙ＝?１．６１０８ｘ－?０．０９２０１，Ｒ２?＝?０．９９９，為葡萄糖標準曲線線性回歸??方程，且線性關(guān)系較好。取每次測得樣品的吸收值，代入相應(yīng)的線性回歸方程，從而獲??得樣品的還原糖含量。??２．１．１３纖維素酶增效活性的測定方法??增效測定方法與濾紙酶活力測定方法［８３］略有改動。其中所有酶活反應(yīng)均為２?ｍｌ??反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為濾紙?５０．０±０．５ｍｇ，０．０６ＦＰＵ／ｇｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，％ｏＥＸＬＸ２?蛋白?２５０ｕｇ，??余下步驟與濾紙纖維素酶活力測定相同，每組做三個平行試驗。增效蛋白的增效活性由??公式２－１表不。??增效活性＝（（扣除空白的蛋白與酶共同作用所產(chǎn)還原糖的量／扣除空白的纖維素酶??單獨水解產(chǎn)的還原糖量）－１）?＊１００％?（２－１）??增效蛋白協(xié)同纖維素酶降解濾紙的增效活性受纖維素酶酶載量和增效蛋白用量的??影響。通常，為了測試預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的酶解效率率或同時糖化和發(fā)酵（ＳＳＦ），??所用纖維素酶量大于５?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ［８？８６］。但纖維素酶和細菌ｅｘｐａｎｓｉｎ之間的協(xié)同作??用，一般在低酶載量０．０１２－０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ條件下有明顯的協(xié)同作用，如在纖維素酶??載量為０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ時，＆ＥＸＬＸ１協(xié)同纖維素酶降解濾紙時幾乎沒有增效作用［５４＼??因此在測定增效蛋白的協(xié)同活性時，纖維素酶載量應(yīng)低于０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ。參考??倫ＥＸＬＸ１這類增效蛋白與纖維素酶協(xié)同時
本文編號：2972050
【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校
【文章頁數(shù)】：75 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖２－１重組質(zhì)粒的圖譜??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇａｍ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??
?（ｃ）重組質(zhì)粒??載體圖譜如圖２－１：與原重組質(zhì)粒不同的是在ＰＥＴ２８ａ質(zhì)粒的Ｃ－末端增加了一個Ｈｉｓ??標簽。提取原Ｓｉｐｏｌ－ｐＥＴ２８ａ⑴－Ｅ．ｃｏｌｉ重組菌的ＤＮＡ，ＰＣＲ擴增，回收擴增序列，通過??ＢａｍＨＩ和Ｘｈｏｌ對原始載體ｐＥＴ２８ａ和ＰＣＲ產(chǎn)物進行酶切，將獲得的片段和載體通過Ｔ４??連接酶連接到載體骨架上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ＤＨ５?ａ中。挑取陽性單克隆測序。??（２ＳＳ?．．?１８２｝?Ｒ?ＸｈＯｌ?；１Ｓ８｝??：??０＾１?｛８３６｝??７ｔａｇ（ｇｃｍｉｉ〇ｔｅａｄ？：｝??ｓｉｔｅ??圖２－１重組質(zhì)粒的圖譜??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇａｍ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??（ｄ）蛋白表達??１）將測序正確的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入ＢＬ２１?（Ｒｉｌ）（全式金）。??２）?挑取單克隆搖菌３７°Ｃ?２２０ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)８￣１２ｈ。將單克隆進行ＰＣＲ鑒定，并將鑒??定正確的菌液按照１％的接種量轉(zhuǎn)接至１５０ｍＬＬＢ培養(yǎng)基中３７°Ｃ繼續(xù)培養(yǎng)表達。??１８??
圖２＿３葡萄糖標準曲線圖??Ｆｉｇ．?２－３?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｇｌｕｃｏｓｅ??圖２－３所示可知，ｙ＝?１．６１０８ｘ－?０．０９２０１，Ｒ２?＝?０．９９９，為葡萄糖標準曲線線性回歸??方程，且線性關(guān)系較好。取每次測得樣品的吸收值，代入相應(yīng)的線性回歸方程，從而獲??得樣品的還原糖含量。??２．１．１３纖維素酶增效活性的測定方法??增效測定方法與濾紙酶活力測定方法［８３］略有改動。其中所有酶活反應(yīng)均為２?ｍｌ??反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為濾紙?５０．０±０．５ｍｇ，０．０６ＦＰＵ／ｇｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，％ｏＥＸＬＸ２?蛋白?２５０ｕｇ，??余下步驟與濾紙纖維素酶活力測定相同，每組做三個平行試驗。增效蛋白的增效活性由??公式２－１表不。??增效活性＝（（扣除空白的蛋白與酶共同作用所產(chǎn)還原糖的量／扣除空白的纖維素酶??單獨水解產(chǎn)的還原糖量）－１）?＊１００％?（２－１）??增效蛋白協(xié)同纖維素酶降解濾紙的增效活性受纖維素酶酶載量和增效蛋白用量的??影響。通常，為了測試預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的酶解效率率或同時糖化和發(fā)酵（ＳＳＦ），??所用纖維素酶量大于５?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ［８？８６］。但纖維素酶和細菌ｅｘｐａｎｓｉｎ之間的協(xié)同作??用，一般在低酶載量０．０１２－０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ條件下有明顯的協(xié)同作用，如在纖維素酶??載量為０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ時，＆ＥＸＬＸ１協(xié)同纖維素酶降解濾紙時幾乎沒有增效作用［５４＼??因此在測定增效蛋白的協(xié)同活性時，纖維素酶載量應(yīng)低于０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ。參考??倫ＥＸＬＸ１這類增效蛋白與纖維素酶協(xié)同時
本文編號：2972050
本文鏈接：http://sikaile.net/projectlw/hxgylw/2972050.html
最近更新
教材專著
