本文為了提高扇貝裙邊的高值化利用,通過蛋白酶酶解扇貝裙邊工藝的優(yōu)化,再對酶解物分離純化獲得ACE抑制肽的結(jié)構(gòu),并通過高血壓動物模型試驗,驗證酶解物的降血壓效果。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.以扇貝裙邊為原料,探究了胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性,其中木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,為71.25%;根據(jù)單因素和正交試驗結(jié)果,確定木瓜蛋白酶酶解扇貝裙邊最佳酶解工藝條件為料液比(g/mL)1:3,加酶量2.0%,酶解溫度60℃,酶解時間1 h,pH 7.0。2.扇貝裙邊酶解物冷凍干燥后,經(jīng)Sephadex LH-20層析柱分離得到七個組分峰,其中F5、F6、F7具有ACE抑制活性,進而通過RP-HPLC(20%乙腈)洗脫后,得到F5-3、F7-2、F7-4具有ACE抑制活性;再次通過RP-HPLC(10%乙腈)進一步純化后,確定F5-3-3、F7-4-3具有ACE抑制活性,而F7-2洗脫出的八個信號組分均具有ACE抑制活性;最后對F5-3-3進行質(zhì)譜鑒定,獲得ACE抑制肽的序列為Val-Trp(VW),分子量303.17 Da,通過合成后測定其IC_(50)為86.9μmol/L。3.對扇貝裙邊來源的ACE抑制肽進行降血壓活性測定。通過超濾膜將扇貝裙邊酶解液截留成不同分子量范圍的樣品,其中分子量范圍為3 KDa~1 KDa酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性更高,其IC_(50)值為0.88 mg/mL,將該部分活性肽以灌胃方式給藥SHR大鼠,通過尾套法測定SBP,結(jié)果顯示,活性肽可顯著降低SHR的SBP,在給藥9天(172±7 mmHg)后,同空白對照組的SBP相比一直表現(xiàn)出極顯著性差異(P0.01),在第28天時其SBP降低到161±3 mmHg,但SHR的SBP高于陽性對照組;在停藥后第7天酶解物組SHR的血壓為169±5 mmHg,同空白對照組的SBP相比仍都表現(xiàn)出了極顯著性差異(P0.01);同時扇貝裙邊活性肽對SHR大鼠的體重增長也有一定的促進作用。第28天停藥后,對SHR血清中ACE,AngⅡ,ATG,ALD進行測定,發(fā)現(xiàn)ACE,AngⅡ,ATG活性及ALD的含量低于空白對照組;而相對于陽性對照組,酶解物組SHR血清中ACE,AngⅡ,ATG的表達水平略高,但ALD的表達水平相對降低。
【學位單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ936.16
【文章目錄】：
縮寫詞
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 扇貝
        1.1.1 扇貝簡介
        1.1.2 扇貝裙邊的營養(yǎng)價值
        1.1.3 扇貝裙邊的加工利用現(xiàn)狀
    1.2 生物活性肽
        1.2.1 生物活性肽的概念
        1.2.2 貝類蛋白源生物活性肽的研究現(xiàn)狀
    1.3 高血壓與ACE抑制劑
        1.3.1 ACE抑制肽降壓機制
        1.3.2 ACE抑制肽的提取方法
        1.3.3 ACE抑制肽的分離純化
        1.3.4 ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定
        1.3.5 ACE抑制肽的活性評估
        1.3.6 ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系
    1.4 本課題的研究目的與意義
    1.5 本課題的主要研究內(nèi)容
第二章 扇貝裙邊ACE抑制肽的酶解工藝優(yōu)化
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 實驗原料
        2.1.2 主要實驗試劑
    2.2 主要儀器設備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 ACE抑制活性的測定
        2.3.2 基本成分測定
        2.3.3 脫鹽工藝
        2.3.4 蛋白酶的篩選
        2.3.5 單因素試驗
        2.3.6 正交試驗
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 基本成分分析
        2.4.2 脫鹽工藝
        2.4.3 蛋白酶的篩選
        2.4.4 單因素試驗
        2.4.5 正交試驗
        2.4.6 驗證試驗
第三章 扇貝裙邊ACE抑制肽的分離純化
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要實驗試劑
    3.2 主要實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 扇貝裙邊酶解產(chǎn)物的制備
        3.3.2 SephadexLH-20層析柱對酶解產(chǎn)物的分離
        3.3.3 反高效液相（RP-HPLC）對活性組分的純化
        3.3.4 ACE抑制肽氨基酸殘基序列的鑒定
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 SephadexLH-20層析柱對酶解產(chǎn)物的分離
        3.4.2 RP-HPLC對活性組分的純化
        3.4.3 ACE抑制肽氨基酸殘基序列的分析
第四章 扇貝裙邊ACE抑制肽降血壓活性研究
    4.1 材料與試劑
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要實驗試劑
    4.2 主要實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 樣品制備
        4.3.2 實驗動物分組
        4.3.3 心臟收縮血壓測定方法
        4.3.4 SHR血清中RAS系統(tǒng)中相關(guān)成分測定
        4.3.5 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理方法
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 灌喂樣品的IC50值
        4.4.2 SHR體重的變化情況
        4.4.3 SHR的SBP變化情況
        4.4.4 SHR血清中RAS系統(tǒng)中相關(guān)指標的影響
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻
攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文
致謝

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