β-丙氨酸是一種天然的β型氨基酸,是重要的醫(yī)藥前提物質(zhì),在保健食品及化工產(chǎn)品中有重要的應(yīng)用。與化學(xué)法合成β-丙氨酸相比,生物轉(zhuǎn)化法具有清潔環(huán)保、轉(zhuǎn)化率高、條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢(shì)。但用于合成β-丙氨酸的L-天冬氨酸α-脫羧酶(ADC)酶活性普遍偏低,且存在嚴(yán)重的機(jī)理性反應(yīng)失活現(xiàn)象,使酶的利用率較低,因此篩選更高活性的L-天冬氨酸α-脫羧酶,以及弱化酶的機(jī)理性反應(yīng)失活現(xiàn)象和改善酶學(xué)性質(zhì),使酶具有更有優(yōu)良的催化特性,利于高效制備β-丙氨酸。本論文異源高效表達(dá)了ADC酶,實(shí)施定點(diǎn)突變,提高酶活力,弱化ADC蛋白的機(jī)理性失活,實(shí)現(xiàn)了高效催化β-丙氨酸。(1)將來源于枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和植物乳桿菌的L-天冬氨酸α-脫羧酶基因(L-aspartateα-decarboxylase,PanD)分別連接到pET-28a載體上,于大腸桿菌中表達(dá)。在16℃、180 r·min~(-1)條件下誘導(dǎo)12 h。經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證,觀察到大小不同的兩條條帶,且誘導(dǎo)表達(dá)后粗酶液可以轉(zhuǎn)化Asp產(chǎn)生β-丙氨酸,說明三種來源的ADC蛋白都成功表達(dá),且能自我剪切成熟。利用E.coli BL21/pET28a-BsPanD菌株進(jìn)行初步的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),確認(rèn)ADC蛋白可以轉(zhuǎn)化Asp生成β-丙氨酸。(2)利用親和層析的方法,對(duì)三種來源的ADC蛋白進(jìn)行純化,純化后的蛋白純度在90%以上。測(cè)定BsADC、CgADC和LpADC的最適溫度分別為65、70和70℃,BsADC、CgADC和LpADC三種蛋白的最適pH分別為7.0、6.5和6.5。在三種酶中,BsADC在酶活和穩(wěn)定性均較好,因而選擇該酶進(jìn)行后續(xù)研究。(3)對(duì)BsADC活性中心附近的Tyr58、Ile60、Glu56、Asn41和Lys63五個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。保守位點(diǎn)Tyr58位的7種突變和Ile60位的飽和突變會(huì)影響B(tài)sADC酶的剪切成熟,使BsADC失活或活性降低;Asn41Gly、Glu56Ser和Lys63Glu三個(gè)突變點(diǎn)不影響酶的剪切成熟,且37℃條件下,酶活相對(duì)于原始酶,提高了1.3-1.6倍。E56S的溫度穩(wěn)定性也略有提升,而N41G和K63E穩(wěn)定性不變;在減緩機(jī)理性反應(yīng)失活現(xiàn)象上,經(jīng)過兩個(gè)小時(shí)的反應(yīng)E56S的殘余酶活是原始酶的1.4倍,而N41G和K63E沒有明顯改善或弱化ADC酶的機(jī)理性反應(yīng)失活現(xiàn)象。(4)將E56S基因分別構(gòu)建在pET-28a、pMA-5和pXMJ-19三種載體上,然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌三種宿主細(xì)胞中。然后采用5 L的發(fā)酵罐進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),收集的菌體在37℃、pH 7.0和600 r·min~(-1)條件下,進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。經(jīng)過9 h的轉(zhuǎn)化,E.coli BL21/pET28a-E56S轉(zhuǎn)化獲得215.3 g·L~(-1)的β-丙氨酸,摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)94%。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ922
【部分圖文】：

圖 1-1 細(xì)菌和真核生物中的 β-丙氨酸合成途徑[14]Fig. 1-1 mechanisms of β-alanine biosynthesis in bacteria and eukaryotesL-天冬氨酸 α-脫羧酶直接催化 Asp 合成 β-丙氨酸；（2）尿嘧啶通過三個(gè)酶的作用降解丙氨酸；（c）精胺通過三個(gè)酶的氧化作用生成 β-丙氨酸。法合成 β-丙氨酸，主要分為酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵代謝法兩種。其中酶法主要以

EcADC蛋白的催化機(jī)理[24]

3-1 天冬氨酸 α-脫羧酶基因的 PCR 擴(kuò)Fig. 3-1 PCR amplification of PanD genrker；1：BsPanD 基因；2：CgPanD 基回收、酶切、酶連，將三種基因分18-T-CgPanD、pMT18-T-LpPanD
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本文編號(hào)：2877667