發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 10:08

　　 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGT酶,EC 2.4.1.19)可通過(guò)環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉或其衍生物合成環(huán)糊精。常見(jiàn)的環(huán)糊精為α-、β-和γ-環(huán)糊精,分別由6、7或8個(gè)葡萄糖構(gòu)成。環(huán)糊精可和眾多客體分子形成包合物,改善其理化性質(zhì)。目前,常選用單一類型環(huán)糊精與客體分子包合,而野生型CGT酶轉(zhuǎn)化淀粉的產(chǎn)物多為三類環(huán)糊精混合物,需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分離純化來(lái)獲取單一環(huán)糊精,因此限制了其規(guī)�；a(chǎn)與應(yīng)用。本論文針對(duì)CGT酶制備環(huán)糊精產(chǎn)物特異性差這一問(wèn)題,對(duì)CGT酶底物結(jié)合亞位點(diǎn)進(jìn)行分子改造,優(yōu)化了α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的制備工藝以及γ-CGT酶發(fā)酵工藝。主要研究結(jié)果如下:(1)-7亞位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)物特異性的影響。通過(guò)序列及結(jié)構(gòu)分析,鑒定了Peanibacillus maceransα-CGT酶的-7亞位點(diǎn),設(shè)計(jì)并獲得多個(gè)突變體,其中單突變D147A、R146P、D147P和雙突變R146A/D147P、R146P/D147A、R146P/D147P的β-環(huán)糊精的合成比活力顯著降低,產(chǎn)物α-環(huán)糊精比率由野生型的63.2%分別提升至68.8%、71.4%、73.0%、75.1%、76.1%和76.8%。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析,提出在-7亞位點(diǎn)處引入脯氨酸殘基封閉氨基酸骨架-NH-與糖單元?dú)滏I以降低β-環(huán)糊精形成,進(jìn)而提高α-環(huán)糊精比率的設(shè)計(jì)改造策略,并在Bacillus stearothermophilus NO2來(lái)源的α/β-CGT酶中得到驗(yàn)證,α/β-CGT酶突變體E142P和T143P產(chǎn)物α-環(huán)糊精比率由野生型的39.5%上升到53.0%和48.7%。(2)-3亞位點(diǎn)對(duì)CGT酶產(chǎn)物特異性的影響。通過(guò)序列及結(jié)構(gòu)分析,設(shè)計(jì)并獲得47位和94位的多個(gè)突變體(以B.circulans 251來(lái)源β-CGT編號(hào)為依據(jù))。在47位點(diǎn)處,P.maceransα-CGT酶突變體K47T的α-環(huán)糊精合成比活力顯著降低,γ-環(huán)糊精合成比活力顯著上升,產(chǎn)物α-環(huán)糊精的比率由55.5%降為39.0%,γ-環(huán)糊精的比率由12.9%提升至17.0%;B.circulans 251β-CGT酶突變體R47T的β-環(huán)糊精合成比活力顯著降低,γ-環(huán)糊精合成比活力顯著上升,產(chǎn)物γ-環(huán)糊精的比率由16.2%提升至19.3%。上述結(jié)果表明,47位長(zhǎng)側(cè)鏈氨基酸R或K側(cè)鏈的移除降低了CGT酶環(huán)化活性,但有利于γ-環(huán)糊精的生成。在94位點(diǎn)處,B.clarkiiγ-CGT酶突變體F91N、F91L的三種環(huán)糊精合成比活力顯著上升,產(chǎn)物γ-環(huán)糊精的比率由野生型的77.1%降為61.4%和62.9%;P.maceransα-CGT酶突變體N94W和B.circulans 251β-CGT酶突變體N94W環(huán)化活性顯著降低,產(chǎn)物γ-環(huán)糊精比率分別由12.9%和16.2%提升至23.4%和25.7%,結(jié)果表明,當(dāng)94位為小側(cè)鏈氨基酸時(shí)有利于CGT酶的環(huán)化反應(yīng)活性,當(dāng)94位為大側(cè)鏈氨基酸時(shí),不利于CGT酶的環(huán)化反應(yīng)活性,但有利于產(chǎn)物γ-環(huán)糊精的生成。(3)中心亞位點(diǎn)、-7亞位點(diǎn)以及與-3亞位點(diǎn)的組合突變對(duì)CGT酶產(chǎn)物特異性的影響。通過(guò)序列及結(jié)構(gòu)分析,設(shè)計(jì)并獲得多個(gè)突變體。在中心亞位點(diǎn)處,P.maceransα-CGT酶突變體Y195W和B.circulans 251β-CGT酶突變體Y195W環(huán)化活性顯著降低,產(chǎn)物中γ-環(huán)糊精比率由12.9%和16.2%分別上升至17.0%和19.3%。B.clarkiaγ-CGT酶突變體Y186W的產(chǎn)物中γ-環(huán)糊精比率由77.6%上升至94.6%。在-7亞位點(diǎn),P.maceransα-CGT酶和B.circulans 251β-CGT酶突變體Δ(145-151)D產(chǎn)物γ-環(huán)糊精比率由12.9%和16.2%分別上升至21.4%和33.7%。采用-7亞位點(diǎn)疏通長(zhǎng)鏈結(jié)合空間,-3亞位點(diǎn)限制彎曲構(gòu)象及中心位點(diǎn)增大被包埋側(cè)鏈的亞位點(diǎn)改造策略,設(shè)計(jì)的組合突變體N94W/Δ(145-151)D/Y195W產(chǎn)γ-環(huán)糊精比率由12.9%和16.2%分別上升至40.3%和45.1%。(4)復(fù)合劑對(duì)CGT酶及其突變體制備環(huán)糊精的影響。研究不同種類的醇類和環(huán)狀復(fù)合劑對(duì)CGT酶及其突變體制備環(huán)糊精的影響。結(jié)果表明,在α-環(huán)糊精的制備中,當(dāng)采用低沸點(diǎn)的正辛醇為復(fù)合劑時(shí),P.maceransα-CGT酶和突變體R146R/D147A環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率分別為56.6%和53.5%,其中α-環(huán)糊精比率分別為73.8%和89.7%,表明選用低沸點(diǎn)的正辛醇為復(fù)合劑制備α-環(huán)糊精時(shí)突變體R146R/D147A更具備優(yōu)勢(shì)。在γ-環(huán)糊精的制備中,以環(huán)十二酮為復(fù)合劑時(shí),采用B.clarkiaγ-CGT酶和突變體Y186W環(huán)糊精總轉(zhuǎn)化率分別為74.4%和72.8%,其中γ-環(huán)糊精比率分別為88.3%和96.6%,表明突變體Y186W制備γ-環(huán)糊精優(yōu)于野生型酶。(5)小分子伴侶對(duì)大腸桿菌生產(chǎn)γ-CGT酶的影響。通過(guò)篩選小分子伴侶及發(fā)酵條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加環(huán)糊精可有效降低γ-CGT酶包涵體形成、提高可溶表達(dá)。搖瓶發(fā)酵中,當(dāng)添加β-環(huán)糊精濃度為7.5 mM時(shí),γ-CGT酶總酶活最高為5.51 U·mL~(-1),是對(duì)照組的1.95倍。在3L發(fā)酵罐中,添加7.5 mMβ-環(huán)糊精,乳糖0.3 g·L~(-1)·h~(-1),γ-CGT酶總酶活可達(dá)到50.29 U·mL~(-1),是對(duì)照組1.71倍。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925
【部分圖文】：

圖 1-1 -、β-和 γ-環(huán)糊精的化學(xué)結(jié)構(gòu)。Fig. 1-1 Chemical construction of -, β-, γ-cyclodextrin.環(huán)糊精具有中空?qǐng)A筒形的立體結(jié)構(gòu)，略呈錐形（圖 1-2）。在環(huán)糊精分子中，所有葡糖均呈現(xiàn)椅式構(gòu)象。葡萄糖 C2 位和 C3 位的仲羥基位于錐形圓筒的寬外側(cè)，葡萄糖

圖 1-2 環(huán)糊精與客體分子的包埋方式[4]。Fig. 1-2 Complexes of cyclodextrin (host) and substrate(guest)[4].糊精的理化生性質(zhì)糊精的物理性質(zhì)

圖 1-3 環(huán)糊精生產(chǎn)工藝。A，控制過(guò)程；B，非控制過(guò)程。Fig. 1-3 Production process of cyclodextrin.A, Solvent process; B, Non-solvent process.
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本文編號(hào)：2876261