毛榛(Corylusmandshurica Maxim.)榛仁粕是生產(chǎn)榛仁油的副產(chǎn)物,更是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源。目前其利用率較低,常被作為飼料或肥料低價出售,榛仁粕的開發(fā)利用可以大大提高毛榛的附加值。本文以脫脂的毛榛仁粕為原料,采用混菌固態(tài)發(fā)酵法制備降血壓肽,篩選最佳發(fā)酵菌種組合并優(yōu)化其發(fā)酵工藝。將制備的降血壓肽進行分離純化,并對其降血壓效果最佳的組分進行氨基酸序列鑒定。最后通過細(xì)胞試驗驗證了毛榛仁粕降血壓肽的功能。1、通過對毛榛仁粕基本成分的測定,毛榛仁粕中蛋白質(zhì)含量高達51.19 g/100g,其還原糖含量較高,可以滿足微生物發(fā)酵所需的碳源和氮源,是較好的生物活性肽制備原料,而且可以作為固態(tài)發(fā)酵的原料。采用固態(tài)發(fā)酵的方法,以蛋白酶活力、水解度、粗多肽得率為指標(biāo)篩選蛋白酶產(chǎn)量較高的菌株。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、米曲霉更適合固態(tài)發(fā)酵榛仁粕;將三種菌株等比接種量兩兩混合,在一定的條件下對毛榛仁粕進行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)采用枯草芽孢桿菌和米曲霉組合菌株發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制率、水解度和粗多肽得率較高,分別為22.11%、21.74%和19.66%,確定枯草芽孢桿菌和米曲霉組合菌株為混菌固態(tài)發(fā)酵的最佳菌種組合。2、在確定混菌固態(tài)發(fā)酵的最佳菌種組合的基礎(chǔ)上,通過單因素試驗和正交試驗對固態(tài)發(fā)酵毛榛仁粕制備降血壓肽的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,優(yōu)化后的最佳工藝條件為枯草芽孢桿菌和米曲霉菌種比例2:3,接種量15%,水分含量60%,發(fā)酵溫度40℃,發(fā)酵時間72 h。在此條件下發(fā)酵樣品的ACE抑制率、水解度及粗多肽得率分別為45.24%,30.13%和 25.53%,其中 ACE 抑制率提高了 104.60%。3、將微生物法制備的毛榛仁降血壓肽進行分離純化,通過超濾法,得到發(fā)酵產(chǎn)物的多肽提取液3個組分,其中組分1(3 KD)的ACE抑制活性最高;進一步采用葡聚糖凝膠(SephadexG-25)對組分1中的多肽進行二次純化,葡聚糖凝膠色譜的最佳分離工藝.:去離子水作為洗脫劑、樣品濃度為50mg/mL(上樣體積1.00mL)、洗脫流速為0.4mL/min的條件下,毛榛仁ACE抑制肽分成3個不同組分。其中G-2組分的ACE抑制抑制率最高達75.46±0.72%,較超濾后的組分1的ACE抑制率提高了 20.06%。4、將G-2組分通過納升級液相色譜-質(zhì)譜(Nano-UPLC-MS)檢測,鑒定其氨基酸序列,通過與BIOPEP數(shù)據(jù)庫對比得到4個多肽,Ala-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Val-Leu(ASFLLRNVL)、Ile-Asp-Tyr-Pro-Asn-Val-Leu-Arg(IDYPNVLR)、Ala-Pro-Leu-Lys-Ala-Phe-Gly-Arg-Thr(APLKAFGRT)、Lys-Lys-Lys-Pro-Glu(KKKPE)分子量分別為1031.6128Da、988.5342Da、959.5552Da、628.3907Da。未匹配的多肽通過DeNovo蛋白質(zhì)測序分析法檢測發(fā)現(xiàn)G-2組分中還有61條具有6～14個氨基酸的短鏈肽,其分子量均小于1.5 KD,經(jīng)過氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)其序列中具有大量的疏水性氨基酸、堿性氨基酸和芳香族氨基酸,占總氨基酸數(shù)的59.97%。由此證明毛榛仁降血壓肽是具有ACE抑制肽特征的多肽。5、利用純化后G-2組分進行細(xì)胞實驗,對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進行培養(yǎng)觀察,并測定培養(yǎng)液中NO、ET的釋放量,結(jié)果顯示添加毛榛仁降血壓肽能促進人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO,而降低ET的釋放。證明毛榛仁降血壓肽降血壓肽在一定濃度范圍具有降血壓藥物卡托普利類似的降血壓作用。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1;TQ464.7
【部分圖文】：

２．４．３發(fā)酵菌種的篩選??２．４．３．１蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立??利用福林法測定蛋白酶活力的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２－２，其回歸方程為：ｙ?＝?〇．〇ｌ〇ｘ?＋??０．００４４，方程的擬合度Ｒ２＝０．９９９３。??０．＃牐潁崳?０．５?■??ｍ?０．４?■??ｌ。３??Ｓ?Ｑ．２?■??ｙ?＝?０．?０１０ｌｘ?＋?０．?００４４??＇?Ｒ２?＝?０．９９９３??〇?＊?？?１?？?１?？?１?■?？?■?？?？?■??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０??氣酸濃度（ｋｇ／ｍｌ）??圖２－２蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．２－２?Ｐｒｏｔｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ??２．４．３．２菌種的篩選??單一菌種發(fā)酵榛仁粕后所產(chǎn)蛋白酶活力、產(chǎn)物水解度和粗多肽得率如圖２－３所示。??３?＂，?３０?ｎ?１２??－獅？?ａ?：卞?炫〕水解沒?＇?－１１??ｎａ?；：＂＞?Ｋ?ｍｍｍ：２６?：⑴??ｍ?〇?４ｂ?－??＊?ｒ?ｐ?ｄ?｜ｂ??＿暴＿＿?＿；ｒ：：ｓ??ｉ：??菌種??字母不同表示差異顯著（ｐ＜〇．〇５）??圖２－３單菌發(fā)酵結(jié)果??Ｆｉｇ．２－３?ｓｉｎｇｌｅ?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ??－１７－??

??如圖２－３可以看出，在接種量和發(fā)酵時間相同的情況下不同菌種所產(chǎn)生的蛋白酶活??力有較大的差別，其中枯草芽孢桿菌最高達２７７３?Ｕ／ｇ；米曲霉次之達１２３６?Ｕ／ｇ；地衣芽??孢桿菌和植物乳桿菌差異不顯著，分別為８１５?Ｕ／ｇ、７９９?Ｕ／ｇ，釀酒酵母最低為５０２?Ｕ／ｇ。??不同菌種發(fā)酵后產(chǎn)物的水解度差異顯著，枯草芽孢桿菌最高達２３．６％；米曲霉次之??達２１．６４％；地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌水解度分別為１９．１１％、１６．６８％；釀酒酵母最低??為１４．８２％；粗多肽得率差異顯著，枯草芽孢桿菌組粗多肽得率最高達１１．４５％；米曲霉??次之達７．５４％；地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌分別為６．７７％、５．２１％，釀酒酵母最低為??４．７４％?〇??綜合對比水解度、粗多肽得率、酶活三個指標(biāo)，枯草芽孢桿菌為最佳菌株，其次分??別為米曲霉和地衣芽孢桿菌，植物乳桿菌雖然與地衣芽孢桿菌酶活力相當(dāng)，但是粗多肽??得率和水解度均低于地衣芽孢桿菌。因此確定枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和米曲霉為??榛仁柏固態(tài)發(fā)酵的適宜菌種。??２．４．４混菌發(fā)酵??混合菌種發(fā)酵榛仁粕后產(chǎn)物的ＡＣＥ抑制率、水解度和粗多肽得率如圖２－４所示。??ｅｚｚ］??＿?ＡＣＥ抑制率??ｈ?ａ??．ｒ

３．３結(jié)果分析及討論??３．３．１菌種比例對降壓肽制備的影響??枯草芽孢桿菌與米曲霉的接種比例對降血壓肽制備的影響如圖３－１。??２５「?…Ａ?１６．５?ｎ２５??１?一▲一水銲度?■?．??忒‘一?■——多肽得率?Ｉ?：?１６０??．２０：?／Ｖ?；／?＼＼?：，４?氣二＇??ｇｗ：?＇／／／?■?＼＞?－？＾ｒ２２ｉ?．??�。�；?／?－?１２．５?＾?＾??１５?－?－?１２．０?？〇??１４?：?２?＾?：丨卜??１３?－?．?＾??１２?１?－?■！？０?－?｜９??ｊ?｜?－?￣?１０，５?＇??１０??ｉ???５?＊?１???１?？?１??１０．０?」ＩＳ??２：！?３：?２?１：１?２：３?１：?２??菌種比例（鈷草芽孢桿菌：米＿霉）??圖３－１不同接種比例對發(fā)酵的影響??Ｆｉｇ．３－１?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎｏｃｕｌｕｍ?ｒａｔｉｏ?ｏｎ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ??－２２－??
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本文編號：2871872