作為廣泛應用的酶之一,由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成的復合纖維素酶在食品、造紙、紡織、動物飼料等諸多行業(yè)起著重要作用。然而,游離的纖維素酶易受外界環(huán)境作用導致酶活性損失,以及難于回收等特點造成了酶的使用成本過高,限制了其大規(guī)模的工業(yè)化應用。通過酶活性保護作用可以解決目前所面臨的這些應用難題。纖維素是地球上含量最為豐富的可再生資源之一,卻沒有得到有效利用,甚至其廢棄物對環(huán)境造成了一定的破壞。利用纖維素酶降解纖維素得到葡萄糖,再進一步發(fā)酵可制得生物燃料乙醇,能夠有效地緩解人類目前面臨的能源危機。實驗以大分子聚乙二醇單甲醚為基礎,合成親水性的大分子單體PEG-MA,再進一步與單體甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)合成聚合度為46的共聚物PEG-g-PDMAEMA。在中性條件下,加入4 mg/mL的帶正電荷的共聚物與0.5mg/mL的活性區(qū)域帶負電荷氨基酸的纖維素酶通過靜電作用相結合,共聚物覆蓋在酶的活性區(qū)域,從而屏蔽外界環(huán)境等不利因素。常溫條件下加入20 mg/mL帶負電荷的聚丙烯酸,與PEG-g-PDMAEMA形成更強有力的靜電作用,纖維素酶得以解吸,從而酶活性幾乎全部恢復。此兩步法人工分子伴侶PEG-g-PDMAEMA/PAAc體系的構建在對酶活力的“開/關”調控基礎上對纖維素酶具有熱保護作用。將PEG-g-PDMAEMA/纖維素酶復合物在90℃下保持20min,仍有58%的相對酶活力得以恢復。通過兩種單體甲基丙烯酰胺(MAA)和丙烯酸(AAc)合成可溶-不溶性UCST型共聚物PMAAc。50℃下,40μg/mL的戊二醛活化載體氨基5 h,隨后共價作用“柔性”固定化纖維素酶,其UCST為19℃。對固定化條件進行了優(yōu)化,35℃下,4 mg/mL的纖維素酶在pH=5.0緩沖溶液中固定化4 h,酶的固載量達到46.6mg/g的最佳值。固定化后的纖維素酶拓寬了pH和溫度作用范圍,且穩(wěn)定性有了顯著提高。由于β-葡萄糖苷酶在復合纖維素酶中的含量較低,而β-葡萄糖苷酶是各組分酶水解協(xié)同作用的最后關鍵一步,因此以β-葡萄糖苷酶為補充酶,與2.5倍量的纖維素酶共同固定化后進行水解,其在24 h后達到平衡的糖化率是單獨的固定化纖維素酶水解的近3倍,且重復水解反應8次后,依然有61%的糖化率。β-葡萄糖苷酶在聚合物PVP保護作用下,與乙酸銅和對氨基苯甲酸(PABA)混合液共沉淀合成基于金屬有機框架Cu(PABA)的固定化酶β-G@Cu(PABA)。優(yōu)化后的乙酸銅和對氨基苯甲酸的濃度分別為50 mM和12.5 mM,共沉淀在pH為7.0的乙酸鈉-乙酸緩沖液中進行,酶濃度選擇為2 mg/mL,固定化8h后的固載量及保留酶活力達到最佳值,分別為162.95 mg/g和81.89%。Cu(PABA)骨架的三維孔道結構為β-葡萄糖苷酶提供了剛性屏蔽環(huán)境,顯著提高了其穩(wěn)定性及有機溶劑耐受性。將β-G@Cu(PABA)和PMAAc-纖維素酶共同催化CMC,并與單獨PMAAc-纖維素酶水解進行對比。水解12 h后達到平衡,在纖維素酶等量條件下,兩種固定化酶共同水解的糖化率較單獨固定化PMAAc-纖維素酶提高近一倍,水解循環(huán)8次后,得到超過70%的糖化率。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925
【部分圖文】：

圖 1.1 纖維素結構[6]Fig. 1.1 Structure of cellulose[6]素酶素酶簡介酶成功應用到商業(yè)市場已有 30 余年，對纖維素酶的基礎研究在食品、動物飼料、釀造、紡織等多個行業(yè)具有很大的應用潛力為生物催化劑酶解纖維素釋放的葡萄糖是生產生物乙醇的主復合纖維素酶所組成的內切及外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶β-(1-4)-糖苷鍵連接而成的纖維素先分解成纖維低聚糖和纖維二糖[13]。復合纖維素酶的生物質轉化過程受多方面因素影響，包定性，產物的抑制作用，協(xié)同作用的組分酶含量，與底物結合

纖維素酶的熱保護及其固定化技術研究圖 1.2（a）[22]。來源于真菌的內切葡聚糖酶的 CBD 區(qū)由成 β-三明治形，如圖 1.2（b）。外切葡聚糖酶的 CBD 結解其氫鍵，從而降低結晶度生成短纖維，為內切葡聚糖酶單獨的 CBD 結構不能獨立完成這一復雜水解過程[23]。

圖 1.2 CBD 的骨架結構[22]Fig. 1.2 Structure of CBD[22]功能區(qū)（CD）[24]3（A），內切葡聚糖酶的 CD 活性部位展開呈現(xiàn)出一條明顯著較多的非極性基團，增強了其疏水性，其中也包含少量要用于與底物結合進行催化作用。底物與 CD 的活性部位，促進纖維素酶與底物接觸，從而有利于對非結晶區(qū)的糖BH 作用提供低聚糖和新的還原末端。如圖 1.3（B），外位為一條孔道，其有利于纖維素的單鏈順利穿過，并且區(qū)進行持續(xù)性催化。
【參考文獻】

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1 高培基,陳冠軍,汪天虹,張穎舒,劉潔;微紫青霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶(CBHI)的纖維素結合結構域及其鏈結區(qū)非水解性破壞纖維素結晶區(qū)結構(英文)[J];生物化學與生物物理學報;2001年01期

2 閻伯旭,齊飛,張穎舒,高培基;纖維素酶分子結構和功能研究進展[J];生物化學與生物物理進展;1999年03期

本文編號：2865386