菜籽粕是壓榨生產菜籽油的副產物,富含優(yōu)質的植物蛋白,其水解產物菜籽多肽具有抗氧化、抑制腫瘤細胞生長以及降血壓等功效。目前,菜籽多肽的制備一般使用蛋白酶水解或中溫微生物發(fā)酵法,但是,酶制劑價格昂貴,中溫發(fā)酵需要消耗大量蒸汽資源對發(fā)酵底物與設備進行徹底滅菌,同時菜籽蛋白經高溫高壓滅菌易變性,在一定程度上影響了菜籽蛋白的轉化效率。利用高溫蛋白酶產生菌對菜籽粕高溫固態(tài)發(fā)酵,能有效抑制發(fā)酵基質中嗜溫污染微生物的生長,可實現(xiàn)不滅菌底物直接發(fā)酵,大幅度降低成本,同時增加底物利用率、提高菜籽多肽產量。本論文首先從菜籽粕中篩選出能高效水解菜籽蛋白的高溫菌,通過對微生物群落結構的分析,以驗證高溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕制備多肽的可行性;采用常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變篩出菌以提高蛋白酶活力,并利用響應面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕制備多肽的工藝參數(shù);最后運用基因組重測序技術初步探究ARTP誘變出發(fā)菌高產高溫蛋白酶潛在機制。本文的主要研究內容及結果如下:(1)通過比較高溫與中溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕底物中菌落總數(shù)的差異,初步探究高溫發(fā)酵的可行性,結果表明高溫發(fā)酵可顯著減少基質中嗜溫微生物的生物量。采用水解圈初篩與蛋白酶活力復篩的方法,成功從菜籽粕中篩選出一株產高溫蛋白酶菌株,命名為RM-2,其蛋白酶活力可達25.50 U/mL,經16S rRNA基因測序,表明菌株RM-2屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)。(2)利用高通量測序技術分析了不同條件固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕基質中的細菌群落組成與豐度,進一步驗證高溫發(fā)酵的可行性,并確定發(fā)酵優(yōu)勢菌種。Alpha-多樣性分析結果顯示,高溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕相比中溫發(fā)酵,基質中的操作歸類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)減少了37.5%,且高溫發(fā)酵優(yōu)勢菌種為土(地)芽孢桿菌屬(Geobacillus),其相對豐度為72.83%;經Beta-多樣性分析,組間樣本存在較大差異,對高溫發(fā)酵組產生顯著性影響的物種為地芽孢桿菌屬(Geobacillus)。(3)以嗜熱脂肪地芽孢桿菌為出發(fā)菌,利用常壓室溫等離子體進行誘變,篩選出高產高溫蛋白酶突變菌。結果表明,在通氣量為10 SLM(標況下升每分鐘,Standard Litre per Minute)、功率為100 W、誘變時間為5 s的條件下,ARTP誘變致死率可達90.5%,并在此條件下以水解圈直徑與菌落直徑之比(K值)為初篩指標、蛋白酶活力為復篩指標,篩選出一株產酶活力較高且能穩(wěn)定遺傳的突變菌株A75,其蛋白酶活力達到32.09 U/mL,相對于出發(fā)菌株提高了25.62%。(4)通過響應面法優(yōu)化了突變菌株A75高溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕制備多肽的工藝參數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)在每20 g不含水發(fā)酵基質中接種10~7 CFU菌量、發(fā)酵時間65 h、料液比1:1.6(g/mL)、發(fā)酵溫度55℃、麩皮添加量20%(W/W)、MgSO_4添加量0.1%(W/W)的條件下,菜籽多肽得率達到最大值6.78%,且小分子蛋白組分與總氨基酸含量較未發(fā)酵組均有所提高,分別提高了15.17%和16.47%。(5)初步探究ARTP誘變嗜熱脂肪地芽孢桿菌機制。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)相對于出發(fā)菌株RM-2,突變菌株A75的菌體變?yōu)槎虠U狀;利用基因組重測序技術,發(fā)現(xiàn)突變菌株A75共發(fā)生了343處單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)非同義突變位點,涉及的基因有121個,將差異基因編碼的氨基酸序列分別在GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)數(shù)據(jù)庫中進行比對,發(fā)現(xiàn)有較多的差異基因參與氨基酸的轉運與代謝、碳水化合物的代謝、細胞膜和細胞壁的組成以及氮化合物的代謝等過程中,說明ARTP誘變儀處理嗜熱脂肪地芽孢桿菌時,活性粒子可能穿透了細胞膜,使細胞內的遺傳物質發(fā)生變化,從而影響了菌體蛋白酶的表達。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ920.1;TS229
【部分圖文】：

呈革蘭氏陽性且菌體為桿狀，結果如圖2.3（b）所示。（2）篩出菌 16S rRNA 鑒定結果圖 2.4 篩選菌株 RM-2 瓊脂糖凝膠電泳條帶Fig. 2.4 Agarose gel electrophoresis strip of screening strain RM-2(b)

2.3 菌株 RM-2 菌落形態(tài)及革蘭氏染色結ny morphology and Gram staining results 的篩出菌 RM-2 進行適當稀釋，并吸上以觀察菌落形態(tài)，結果表明 RM-狀且邊緣清晰，如圖 2.3（a）所示10×100）下觀察，呈革蘭氏陽性且 rRNA 鑒定結果

圖 3.2 發(fā)酵基質樣本的稀釋性曲線Fig. 3.2 Rarefaction curves of fermentation substrate samples如圖3.2所示，對照組隨著測序深度的加大，觀測到的OTU數(shù)目迅速增加，并且顯著大于其他三組樣本中的 OTU 數(shù)目，這與 Alpha-多樣性指數(shù)分析的結果一致。當測序深度繼續(xù)加深時，四個樣本的稀釋性曲線都趨于平緩，說明此次測序已達到飽和，測得的數(shù)據(jù)量足以代表樣本中的全部物種信息，無需增加測序量，進一步表明此次高通量測序數(shù)據(jù)足以分析不同條件固態(tài)發(fā)酵菜籽粕對發(fā)酵基質中的細菌群落結構的影響。3.4.5 發(fā)酵基質樣本中細菌群落結構分析為了更深一步獲得不同條件固態(tài)發(fā)酵菜籽粕對發(fā)酵基質中細菌群落結構影響的具體信息，首先從科分類水平上了解樣本內的物種組成，選取豐度在前 20的物種進行分析
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本文編號：2854961