二十二碳六烯酸(DHA)屬于ω-3不飽和脂肪酸,對嬰幼兒的腦部和視網(wǎng)膜發(fā)育極為重要。木質纖維素來源豐富且環(huán)保,分布廣泛,價格低廉,木質纖維素作為可再生及環(huán)保的新能源是未來能源利用和開發(fā)的一個趨勢。本文以裂殖壺菌Aurantiochytrium sp.FJU-512為出發(fā)菌株,建立了裂殖壺菌常溫常壓等離子體(ARTP)誘變及自然馴化的方法,獲得了對木質纖維素水解液抑制物高耐受性和高產(chǎn)DHA的菌株。在此基礎上,對裂殖壺菌突變株在甘蔗渣水解液培養(yǎng)基中培養(yǎng)進行了搖瓶條件優(yōu)化以及5L發(fā)酵罐的發(fā)酵條件優(yōu)化。同時,對突變菌株與原始菌株進行了轉錄組學分析以闡述突變株的耐受機制。最后,為獲得新的功能性化合物,對裂殖壺菌的胞外產(chǎn)物進行分離、純化以及結構鑒定。本文建立了甘蔗渣水解液平板馴化以及ARTP誘變后利用水解液平板作為篩選培養(yǎng)基的方法。通過甘蔗渣水解液平板自然馴化獲得突變株Aurantiochytrium sp.FN-21,以葡萄糖為碳源培養(yǎng)時,DHA的產(chǎn)量由5.38 g/L提高到了6.5 g/L,提高了20.8%,甘蔗渣水解液培養(yǎng)時,DHA產(chǎn)量由1.23 g/L提高到了2.46 g/L,提高了 100%。通過ARTP誘變獲得突變株Aurantiochytrium sp.FNA8,DHA產(chǎn)量由5.38 g/L提高到了 6.56 g/L,產(chǎn)量提高了 21.9%,甘蔗渣水解液培養(yǎng)時由1.23 g/L提高到了2.36 g/L,提高了91.9%。為了進一步提高DHA的產(chǎn)量,進行了氮源的優(yōu)化,確定了以Aurantioc-hytrium sp.FNA8為出發(fā)菌株在甘蔗渣水解液添加22 g/L的玉米漿粉,最終DHA的產(chǎn)量達到了5.08 g/L。最后,利用5 L罐上進行驗證及進一步優(yōu)化,以稀釋一倍的水解液作為初始培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后補料發(fā)酵,最終DHA產(chǎn)量達到了 8.63 g/L。裂殖壺菌利用纖維素水解液生產(chǎn)DHA具有很高的工業(yè)應用價值。本文對突變株Aurantiochtrium sp.FN21和原始菌株Aurantiochytrium sp.FJU-5-12在水解液中培養(yǎng)至對數(shù)前期和對數(shù)期的菌取樣測序,進行RNA-seq轉錄組學分析。發(fā)現(xiàn)在TCA循環(huán)、氨基酸的生物合成、脂肪酸代謝和芳香族化合物的降解等四個代謝過程中的一些基因轉錄水平發(fā)生了顯著上調,分析這些途徑可能與Aurantio chytrium sp.FN21的纖維素水解液耐受性有關。選取無蛋白胨、酵母膏的培養(yǎng)基進行裂殖壺菌的200 L罐發(fā)酵,發(fā)酵液通過離心、萃取獲得了9g粗提液。粗提液利用正相硅膠柱、反向硅膠柱和凝膠柱進行分離,最終獲得5種化合物。利用質譜進行物質結構的分析和鑒定。選取其中一種可能具有研究價值的甾醇類進行1H譜和13C NMR譜等推測該化合物為(E-17-(5-ethly-6-methylhept-3-en-2-ly)-10,13-dimethyl-1,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-do-decahydro-2H-5,8-epidloxycyclopenta[a]phenanthren-3-ol。該化合物分子式為 C29H46O3,分子量442.67,是海洋微生物次級代謝產(chǎn)物中有價值的一種甾醇。
【學位單位】：福建師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ929
【部分圖文】：

?福建師范大學碩士學位論文???菌種的改造和發(fā)酵條件的優(yōu)化是提高微生物中目標產(chǎn)物較為常用的方法，菌種??的改造主要集中在傳統(tǒng)的誘變以及對菌株進行基因工程的改造方面。許永等利用紫??外誘變結合喹禾靈篩選的方法使裂殖壺菌種ＤＨＡ的產(chǎn)量提高了?１３．４％１＠。由于裂??殖壺菌是真菌，基因工程改造存在一定的難度，目前通過基因工程改造裂殖壺菌的??報道較少。Ｘｉａｏｙａｎ?Ｚｈｕａｎｇ等利用電轉將Ｇ４１８抗性和ｂｌｅ基因成功導入裂殖壺菌中，??但ＤＨＡ產(chǎn)量未明顯改變＿。發(fā)酵后期低Ｃ／Ｎ比、低溫、低轉速均有利于ＤＨＡ的??產(chǎn)生，因此裂殖壺菌發(fā)酵條件的優(yōu)化主要集中在前期碳源持續(xù)的供給、后期氮源的??持續(xù)補加、后期低溫和低轉速等方面［３１１。??

經(jīng)過一系列的還原、縮合反應生成棕櫚酸（Ｃ１６：?０），棕櫚酸在一系列的延長酶和??去飽和酶的作用下生成ＤＨＡ。而細菌等原核生物中的長鏈多不飽和脂肪酸通常采用??厭氧聚酮合酶（ＰＫＳ）途徑合成１２８］。如圖３所示，脂酰－ＡＣＰ和丙二酸單酰－ＡＣＰ在??厭氧條件下經(jīng)過一系列的縮合，加氫，還原，脫氫等反應最后生成ＤＨＡ。本文以裂??殖壺菌作為ＤＨＡ發(fā)酵菌株，一般認為裂殖壺菌中ＤＨＡ和ＤＰＡ由ＰＫＳ途徑合成，??而其他的短鏈脂肪酸由ＦＡＳ途徑合成％。陳偉等利用了淺藍菌素對ＦＡＳ途徑的不??可逆抑制，分別在甘油和葡萄糖中培養(yǎng)，確定了裂殖壺菌中存在的ＰＫＳ和ＦＡＳ途??徑均可以合成ＤＨＡｔ２７］。??１．４裂殖壺菌中ＤＨＡ產(chǎn)量的優(yōu)化??－３－??

以木質纖維素為原料生產(chǎn)微生物油脂的生物煉制技術??隨著社會的發(fā)展，石油、天然氣和煤等化石資源的大量開采用于制備燃料和品。導致自然資源消耗殆盡，環(huán)境污染難以治理，所以發(fā)展可再生的能保護環(huán)新能源迫在眉睫１３２］。木質纖維素來源豐富，分布廣泛，價格低廉，生成過程中收Ｃ〇２有利于保護環(huán)境。所以木質纖維素的利用和開發(fā)來代替化石能源獲得了的關注。??２．１木質纖維素??木質纖維素主要由木質素，纖維素和半纖維素組成，一般來說纖維素比０％－６０％、半纖維素為２０％－４０％、木質素為１５％－２５％，還有少量的灰分、礦物構蛋白等物質［３３１。木質纖維素的種類眾多，如下圖四所示：有甘蔗渣，玉米棒稻草秸桿等１Ｗ。??
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本文編號：2845157