隨著人們對抗生素濫用的重視,益生菌越來越廣泛地應(yīng)用于飼料、食品和醫(yī)藥行業(yè),乳酸菌作為一種微生物資源因此受到越來越多的關(guān)注。乳酸菌高密度規(guī)模發(fā)酵是為提高菌體的發(fā)酵密度而使用的技術(shù)手段和特殊的培養(yǎng)裝置,使菌體密度相較于普通培養(yǎng)方式能有顯著的提高,最終提高菌細胞的產(chǎn)出率的一種擴大培養(yǎng)方式。在實際生產(chǎn)過程中,乳酸菌菌體密度是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的重要指標(biāo)。本試驗以嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌為研究對象,篩選適合其增殖的培養(yǎng)基,研究適合乳酸菌的培養(yǎng)條件,優(yōu)化乳酸菌中試高密度發(fā)酵工藝以及冷凍干燥保護劑組成。本文的研究結(jié)果如下:(1)兩株乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征乳酸乳球菌在MRS培養(yǎng)基上可以形成明顯的白色菌落,直徑在1mm左右,圓形邊緣整齊,不透明,表面光滑無皺褶。在添加碳酸鈣的固體培養(yǎng)基中,菌落周圍由于產(chǎn)酸形成透明的水解圈。顯微鏡下觀察,細菌成球形,不形成鏈狀。嗜酸乳桿菌在MRS培養(yǎng)基上可以形成明顯的菌落。菌落圓形、白色、凸起,表面光滑、邊緣較光滑,直徑在1mm左右。在添加碳酸鈣的固體培養(yǎng)基中,菌落周圍形成透明水解圈。在顯微鏡下觀察,細菌成短桿狀。兩株乳酸菌通過革蘭氏染色均為紫色,是革蘭氏陽性菌。(2)乳酸菌培養(yǎng)條件前期發(fā)酵條件優(yōu)化前期實驗室工作通過對兩株乳酸菌的條件優(yōu)化摸索,確定了以乳清粉為中試培養(yǎng)基,并確定乳酸乳球菌的最適培養(yǎng)溫度在37℃C左右、初始培養(yǎng)基pH值在6.5、接種量在2%-7%之間,而接種量對最大活菌數(shù)的影響并不顯著。培養(yǎng)28h可獲最多的活菌,最大活菌數(shù)為 1.92±0.15×108CFU/mL;嗜酸乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度在37℃C左右、初始培養(yǎng)基pH值在6-6.5、接種量在5%-7%之間。嗜酸乳桿菌在乳清粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)32h可獲得最大活菌數(shù)為1.53±0.15 × 1 08 CFU/mL。(3)高密度規(guī)模化發(fā)酵工藝優(yōu)化隨著乳清粉含量的增加,通過離心獲得的乳酸菌干重是不斷增加的。當(dāng)乳清粉含量增加至60%時,細胞干重(DCW/L)增加至13.21 g/L。通過乳清粉的添加,可以顯著提高發(fā)酵罐中乳酸菌的細胞干重。而從菌粉獲得率計算,當(dāng)乳清粉含量增加至60%時,嗜酸乳桿菌獲得率增加至23.42%。(4)冷凍干燥保護劑優(yōu)化通過對離心獲得的菌體添加10%的脫脂奶粉和10%的葡萄糖,或添加10%脫脂奶粉和10%海藻糖能夠達到較高的復(fù)蘇率。通過進一步篩選得到四種具有顯著保護性能的保護劑,并通過對乳酸乳球菌冷凍干燥保護劑的四因素三水平正交實驗,結(jié)果得出這四種因素對于冷凍干燥后復(fù)蘇率的影響,從大到小的順序依此是葡萄糖硫酸錳脫脂奶粉海藻糖。這四個因素對于冷凍干燥后的復(fù)蘇率的影響都是極顯著的,是影響該實驗結(jié)果的主要因子。通過正交實驗,確定了一種凍干保護性較強的凍干保護劑組合,這種凍干保護劑配比為每公斤菌體添加葡萄糖90g、海藻糖90g、硫酸錳60g、脫脂奶粉30g。冷凍干燥后的菌粉在儲藏時應(yīng)保持低溫的環(huán)境,本次實驗制備的兩種菌粉在-20℃C環(huán)境下密封保存4周后,存活率仍能超過50%。(5)乳酸菌耐受實驗兩株凍干菌粉對于人工消化液均有一定的耐受能力,乳酸乳球菌在人工胃液中模擬消化3h存活率9.3%。在人工腸液中,經(jīng)過4h的模擬消化過程,乳酸乳球菌的存活率為8.6%。以活菌數(shù)計算,通過7h的模擬消化過程,仍有超過108CFU/g的活菌數(shù);而嗜酸乳桿菌菌粉相對于乳酸乳球菌對于人工胃液的耐受能力更穩(wěn)定,經(jīng)過3h的人工胃液模擬消化,由3.64×1010CFU/g下降到5.9×109CFU/g,存活率為16.3%。在人工腸液中,經(jīng)過4h的模擬消化過程,嗜酸乳桿菌的存活率為2.3%,經(jīng)過7h的模擬消化過程,嗜酸乳桿菌菌粉的活菌仍能超過108CFU/g。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.6
【部分圖文】：

改進培養(yǎng)方式，提高活菌量。同時，對發(fā)酵結(jié)束后的菌體通過高速離心、真空??冷凍干燥的方法制成菌粉，并對凍干過程中需要添加的干燥保護劑類型進行研宄，通過實??驗室的初步實驗、企業(yè)生產(chǎn)前的中試，得出兩株乳酸菌菌劑的最佳生產(chǎn)條件（圖１－１）。??

圖２－１乳酸乳球菌的菌落形態(tài)（Ａ）和革蘭氏染色后的鏡檢照片（Ｂ）??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃｏｌｏｎｙ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?（Ａ）?ａｎｄ?ｃｅｌｌ?ｍｏｉｐｈｏｌｏｇｙ?ｕｎｄｅｒ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?ａｆｔｅｒ?Ｇｒａｍ?ｓｔＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ?ｌａｃｔｉｓ?ｓｕｂｓｐ．?Ｌａｃｔｉｓ??乳酸乳球菌在ＭＲＳ培養(yǎng)基上培養(yǎng)４８ｈ后，可以形成明顯的菌落。菌落呈白色，

?落較小，直徑在ｌ－２ｍｍ之間，圓形邊緣整齊，不透明，表面光滑無皺褶，在添加碳酸鈣??的固體培養(yǎng)基中，菌落周圍形成透明圈（圖２－１Ａ）。對液體培養(yǎng)基中的乳酸乳球菌染色后??在油鏡下觀察，細胞成球形，不形成鏈狀（圖２－１Ｂ）。??２．３．１．２培養(yǎng)時間??將活化后的乳酸乳球菌以２％的接種量，分別接種在裝有ｌＯＯｍＬ?ＭＲＳ液體培養(yǎng)基的??２５０ｍＬ三角瓶中，３７°Ｃ靜置培養(yǎng)，每４ｈ測定６００ｎｍ處的ＯＤ值，由此獲得乳酸乳球菌生??長曲線。??由乳酸乳球菌的生長曲線（如圖２－２）可以看出，該株乳酸乳球菌在８－２４ｈ時ＯＤ值??增長迅速，在２４ｈ后趨于穩(wěn)定，若出于獲得最大活菌數(shù)的目的，應(yīng)在２８－３２ｈ之間進行菌??體收集。??１．０?ｒ??０．９??０．８??Ｍ?＊?Ｍ??０７??！?°．６?／??ｇ?０．５?－?Ｖ??°４??〇?３?．??０．２?＾??０．１??〇〇??ｉ??．１?１?Ｉ?ｉ??Ｉ?１?Ｉ?１?Ｊ??０?４?８?１２?１６?２０?２４?２８?３２?３６?４０?４４??時間（ｈ）??圖２－２乳酸乳球菌的生長曲線??Ｆｉｇ．２－２?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?Ｌａｃｌｏｃｏｃｃｕｓ?ｌａｃｔｉｓ?ｓｕｂｓｐ．?ｌａｃｔｉｓ??２．３．１．３發(fā)酵溫度??通過對乳酸乳球菌生長曲線的測定，確認乳酸乳球菌的對數(shù)生長期結(jié)束時間為２８ｈ，??穩(wěn)定期在２８－３２ｈ之間。隨后，通過設(shè)定２５、３０、３５、３７和４０?°Ｃ等不同培養(yǎng)溫度。以同樣??２％的接種量將活化后的乳酸乳球菌分別接種至初始ｐＨ值為６．５的１００?ｍＬ?ＭＲＳ液體培養(yǎng)??基中
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本文編號：2840424