發(fā)布時間：2020-10-13 18:00

　　 光學(xué)活性手性醇已被公認(rèn)為合成精細(xì)化學(xué)品和藥物的關(guān)鍵手性中間體,羰基還原酶催化還原潛手性羰基化合物具有高化學(xué)選擇性、對映體選擇性和區(qū)域選擇性,是制備手性醇的單一對映異構(gòu)體的有效方法。然而,工業(yè)中使用的大部分潛手性酮在結(jié)構(gòu)上是復(fù)雜的,比如芳香酮、酮酯和雜環(huán)酮,底物分子大小引起的酶活性缺陷仍然是酶促還原酮的一個挑戰(zhàn)。因此,有必要開發(fā)可催化還原具有龐大基團(tuán)的底物的酶,用于生產(chǎn)高光學(xué)純度的手性醇。本研究開發(fā)和構(gòu)建了大分子酮還原酶工具箱,嘗試以多種芳香酮、酮酯、雜環(huán)酮為底物,考察各酶的催化性能和立體選擇性,實(shí)現(xiàn)了多種醫(yī)藥中間體的高立體選擇性制備,并探究了 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)和1-芐基-3-吡咯烷酮不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響因素,具體研究內(nèi)容如下:(1)通過基因挖掘獲得新型醛酮還原酶,包括來源于Candida albicans的CaCR、來源于Saccharomyces cerevisiae ScCR 以及來源于Kluyveramyces marianus的 KmCR,同時挖掘到來源于C.parapsilosis的醛酮還原酶CPR-C1和CPR-C2。構(gòu)建重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-CaCR、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-ScCR、E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-KmCR,通過IPTG誘導(dǎo)使目的蛋白活性表達(dá),構(gòu)建大分子酮還原酶工具箱。除此之外,羰基還原酶RCR的兩種突變體F285A/W286A和W116A,也作為本研究的大分子酮還原酶工具箱中的成員。通過對各羰基還原酶進(jìn)行Ni親和層析柱純化,獲得SDS-PAGE顯示單一條帶的純酶。(2)以芳香酮、酮酯和雜環(huán)酮類化合物作為底物,考察大分子酮還原酶工具箱的催化性能。結(jié)果顯示,各羰基還原酶均對一到幾種大分子底物具有活性,與其他酶相比,ScCR顯示出更廣泛的底物特異性。大部分酶都具有潛在催化還原苯甲酰甲酸乙酯的能力。對與底物親和力相關(guān)的Kn值分析,發(fā)現(xiàn)酶作用大分子底物的催化規(guī)律。(3)探究重組羰基還原酶的立體選擇性,結(jié)果顯示酶促反應(yīng)生成的手性醇構(gòu)型與其在工業(yè)應(yīng)用上的需求相一致,以大于99%的對映體過量值生成(R)-扁桃酸甲酯、(R)-扁桃酸乙酯、(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE)、(5)-3-羥基-3-苯基丙酸乙酯以及(5)-1-芐基-3-吡咯烷醇。(4)分別探究反應(yīng)體系組成和條件對OPBE、1-芐基-3-吡咯烷酮不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示以F285A/W286A催化還原OPBE時,當(dāng)pH 7.0,反應(yīng)溫度30℃,3.5%(v.v-1)異丙醇作助溶劑,加入1 g.L-1底物,反應(yīng)12h時,產(chǎn)率為80.3%,對映體過量值大于99%。而以W116A催化還原1-芐基-3-吡咯烷酮時,當(dāng)加入60%(v·v-1)異丙醇、0.5 g.L-1底物時,產(chǎn)率為75.2%,對映體過量值大于99%。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925
【部分圖文】：

線菌和微藻類實(shí)現(xiàn)了一些ａ－酮酯和糸酮酯的微生物還有高轉(zhuǎn)化率和優(yōu)異的立體選擇性［３７，３＇??作為光學(xué)活性物質(zhì)，是重要的精細(xì)化工中間體和藥物中生物是合成環(huán)扁桃酯、羥芐唑、匹莫林等血管擴(kuò)張劑、間體。高炳學(xué)等人采用實(shí)驗(yàn)室篩選到的釀酒酵母ＬＨ，合成（／？）－（－）－扁桃酸甲酯產(chǎn)率為９４．３％，對映體過量值為ｌ．Ｌ－１［４２］。??０??ｆ??ｊ?Ｉ?〇ｒ??圖１－１苯甲酰甲酸甲酯的還原??Ｆｉｇ．１－１?Ｔｈｅ?ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｅｔｈｙｌ?ｂｃｎｚｏｙｌｆｏｒｍａｔｅ??酯是有機(jī)合成中重要的手性砌塊，是環(huán)丙烯酸酯、氫化，用于立體化學(xué)研究［４３］。底物苯甲酰甲酸乙酯因與丙化還原的底物。ＭＵａｇｒｅ等人采用經(jīng)藻酸鈣纖維和雙層ｒｅｖ／．ｙ／ｆｌｅ將苯甲酰甲酸乙酯成功還原為（７？）－扁桃酸乙醋，］。??

用于立體化學(xué)研究。底物苯甲酰甲酸乙酯因與丙酮酸微生物催化還原的底物。ＭＵａｇｒｅ等人采用經(jīng)藻酸鈣纖維和雙層凝ｍｊＦｃｅｓ＇ｃｅｒｅｖ／．ｙ／ｆｌｅ將苯甲酰甲酸乙酯成功還原為（７？）－扁桃酸乙醋，產(chǎn)率％？９７％１４４］。??１?〇?ｆ??ｒ?ｔ?Ｉ?￣￣ｒ??圖１－２苯甲酰甲酸乙酯的還原??Ｆｉｇ．?１－２?Ｔｈｅ?ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｅｔｈｙｌ?ｂｅｎｚｏｙｌｌｏｒｍａｔｃ??羥基－４－苯基丁酸乙酯（（／？＞ＨＰＢＥ）作為血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶（ＡＣＥ）抑制，可用于治療高血壓，比如西拉普利、依那普利、貝那普利、雷米普４１＾。（／？＞丨丨ＰＢＥ可通過２－氧代－４－苯基丁酸乙酯（ＯＰＢＥ）的不對稱還原來等人利用各種不同微生物催化還原ＯＰＢＥ，利用Ｓ?合成了⑶－最値９５％；利用Ａ７ｗ＿ｙｖｅｒａｍｙｃｅｓ?以３２％的對映體過最值合＜；］。后又篩選到一株畢赤酵母能夠不對稱還原ＯＰＢＥ，生成（幻－ＨＰＢＥ，對映體過量值８１％｜ｌ１６］。丨兒曄等人通過從霉菌和６２種酵付中篩選ＭｉＷ２０２６作為高效催化劑，底物濃度２．５?ｇ．Ｌ＇對映體過量值９９．７０丨。??

?第一章緒論氟西汀、托莫西汀、尼索西汀是一類治療抑郁癥的重要藥物，可以專一性抑體內(nèi)去甲腎上腺素和５－羥色胺的吸收［５ｋ?５２１，?（Ｑ－３－羥基－３－苯基丙酸乙酷紀(jì)其合成的中間體，（５＞３－羥基－３－苯基丙酸乙酯的合成方法之一是苯甲酰基乙酸乙酯的不對原。Ｈ．?Ｅｎｇｅｌ?ｋｉｎｇ范人構(gòu)建＿Ｔ?一株同時表達(dá)Ｘ?ｃｅｒｅｖ／ｈａｅ的脂肪酸合成酶和??的葡萄糖脫氫酶的Ｓ．?ｃｅｒｅｖ加此，催化還原苯甲�；宜嵋阴ド桑ǎ担荆常u苯基丙酸乙酯。該轉(zhuǎn)化反應(yīng)在０．５?Ｌ的攪拌槽中進(jìn)行，底物濃度５５?ｍｍｏｌ＋?Ｌ＇反應(yīng)ｈ，產(chǎn)率為７４％，對映體過量值達(dá)到９７％１５３＇５４１。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2839507