還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)在維持谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)細(xì)胞生長(zhǎng)和L-賴氨酸合成中起重要作用。該文通過敲除參與C.glutamicum胞內(nèi)NADPH合成途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf和蘋果酸酶基因malE,并將自身NADP~+-依賴型異檸檬酸脫氫酶基因icd_(Cg)替換為變形鏈球菌(Streptococcus mutans)NAD~+-依賴型異檸檬酸脫氫酶基因icd_(Sm),構(gòu)建一株阻斷胞內(nèi)NADPH合成的工程菌株C.glutamicum LYS?zwf?malE?icd_(Cg)::icd_(Sm)。并比較分析阻斷胞內(nèi)NADPH合成對(duì)菌體生長(zhǎng)、葡萄糖代謝和L-賴氨酸合成的影響。通過添加不同濃度的NADPH溶液以確定維持細(xì)胞L-賴氨酸合成能力最適NADPH閾值范圍,并分析胞內(nèi)微環(huán)境參數(shù)的變化規(guī)律,從而初步解析胞內(nèi)輔因子NADPH水平調(diào)控胞內(nèi)微環(huán)境的生理機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:(1)重組菌胞內(nèi)NADPH含量降低至0.15μmol·(g DCW)~(-1),明顯低于出發(fā)菌1.43μmol·(g DCW)~(-1),同時(shí)胞內(nèi)NADH含量由出發(fā)菌1.97μmol·(g DCW)~(-1)提高至2.73μmol·(g DCW)~(-1),實(shí)現(xiàn)了異檸檬酸脫氫酶輔酶依賴型的轉(zhuǎn)變。ATP含量降低13.10%,而ADP和AMP含量均有所升高。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,重組菌葡萄糖代謝能力明顯減弱,生長(zhǎng)也相對(duì)緩慢,菌體生物量降低4.36%。同時(shí)L-賴氨酸產(chǎn)量降低87.69%,而在胞內(nèi)積累了大量副產(chǎn)物,如丙酮酸、乳酸等。(2)培養(yǎng)基中添加不同終濃度NADPH溶液考察其對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度的影響。與未添加NADPH相比,當(dāng)NADPH終濃度為0.2 mmol·L~(-1)、0.5 mmol·L~(-1)、1 mmol·L~(-1)、2mmol·L~(-1)和4 mmol·L~(-1)時(shí)菌體生物量分別提高7.98%、11.77%、22.28%、15.86%和6.52%,L-賴氨酸產(chǎn)量分別提高1.16倍、4.87倍、9.59倍、11.54倍和7.61倍,而L-賴氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高0.08倍、3.36倍、6.84倍、8.96倍和6.14倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在培養(yǎng)基中添加一定量輔因子NADPH時(shí),菌體生長(zhǎng)、L-賴氨酸產(chǎn)量及其生產(chǎn)強(qiáng)度均得到了一定恢復(fù),當(dāng)過量添加時(shí)其促進(jìn)作用均明顯減弱。伴隨著NADPH含量的提高,L-賴氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度呈現(xiàn)出先逐漸增強(qiáng)后逐漸減弱的趨勢(shì)。(3)對(duì)不同NADPH閾值濃度0 mmol·L~(-1)、0.5 mmol·L~(-1)、2 mmol·L~(-1)和4 mmol·L~(-1)下胞內(nèi)能量輔因子(AMP,ADP,ATP)、氧化還原輔因子(NAD~+,NADH,NADP~+,NADPH)、乙酰-CoA和活性氧簇(ROS)進(jìn)行定量分析和差異比較,并初步解析了胞內(nèi)輔因子NADPH水平調(diào)控胞內(nèi)微環(huán)境的生理機(jī)制。當(dāng)NADPH閾值濃度為0 mmol·L~(-1)、0.5mmol·L~(-1)、2、4 mmol·L~(-1)時(shí)胞內(nèi)NADPH水平分別為0.15μmol(g DCW)~(-1)、0.24μmol(g DCW)~(-1)、1.83μmol(g DCW)~(-1)和2.65μmol(g DCW)~(-1),ATP水平分別為4.21μmol(g DCW)~(-1)、4.32μmol(g DCW)~(-1)、4.48μmol(g DCW)~(-1)、4.67μmol(g DCW)~(-1),胞內(nèi)ROS水平分別提高1.35%、1.79%和15.21%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)NADPH閾值濃度低于2 mmol·L~(-1)時(shí),閾值濃度的提高可以有效提高胞內(nèi)NADPH、ATP水平和L-賴氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度,降低胞內(nèi)NADH水平,增強(qiáng)乙酰-COA供給并強(qiáng)化中心碳代謝途徑。然而當(dāng)NADPH閾值濃度超過2 mmol·L~(-1)時(shí),閾值濃度的提高使得L-賴氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度逐漸降低,同時(shí)胞內(nèi)NADH水平提高并伴隨著乙酰-CoA減少,中心碳代謝弱化。此外,在高NADPH閾值濃度下活性氧簇(ROS)增強(qiáng),而過高的ROS水平引起細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,菌體生物量減少。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ922.3;Q78
【部分圖文】：

第一章 緒論第一章 緒 論理化性質(zhì)腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinu原型輔酶Ⅱ，是動(dòng)、植物以及微生物細(xì)胞內(nèi)極其重質(zhì)量為 744.41，分子式為 C21H29N7O17P3，其結(jié)構(gòu)觀呈現(xiàn)白色粉末狀，在自然條件下極易潮解。易體可在 0℃或密封干燥的室溫環(huán)境中穩(wěn)定存在[2]。

NADPH 可以減少細(xì)胞內(nèi)氧化型化合物，從而維持細(xì)胞中的最佳對(duì)微生物產(chǎn)物積累具有顯著影響，如在 Corynebacterium glutmicum 中成途徑均需NADPH提供還原力，其中L-賴氨酸合成所需的NADPH因子 NADPH 工程來強(qiáng)化代謝產(chǎn)物的積累[13-17]。子 NADPH 的代謝途徑、植物以及微生物細(xì)胞中普遍存在 NADPH 合成代謝途徑，如在戊糖)以及 TCA 循環(huán)中存在某些酶可以將 NADP+催化還原成 NADPH，當(dāng)酶途徑可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi) NADH(NAD+)和 NADPH(NADP+)相互轉(zhuǎn)化。NA化而形成 NADPH，同時(shí)也可通過 NAD 激酶先將 NAD+磷酸化形成胞內(nèi)多種 NADP+依賴型脫氫酶催化作用，將 NADP+還原成 NADPH如大腸桿菌(E. coli)中還存在兩種不同類型的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，該酶 與 NADH 之間的互相轉(zhuǎn)變。DPH 的常規(guī)合成途徑

圖 1-3 異檸檬酸氧化脫羧反應(yīng)Fig. 1-3 The oxidative decarboxylation of isocitrate目前在自然界高等動(dòng)、植物和大多數(shù)微生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)存在兩種輔酶依賴型不同檸檬酸脫氫酶，一種是以 NAD+為輔酶，需要以鎂離子或錳離子激活，這種酶只存線粒體中，另一種則是在胞內(nèi)線粒體以及細(xì)胞基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的以 NADP+為輔酶的異酸脫氫酶。該酶參與催化氧化脫羧反應(yīng)，解決了動(dòng)物，植物和微生物細(xì)胞乙�；踅到獾膯栴}，這在生物學(xué)中具有重要意義。同時(shí)該酶還是一種活性會(huì)被 ADP 變構(gòu)的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) ADP 水平改變其與底物之間的親和性以調(diào)控代率。研究發(fā)現(xiàn)，在 Saccharomyces cerevisiae S288C、家鼠以及人類等細(xì)胞胞漿中該以 NADP+為輔因子,并將其還原為 NADPH[22, 23]。.2.2 NAD 激酶途徑NAD 激酶包含 NAD+激酶和 NADH 激酶這兩種類型，該酶通過以 ATP 或多聚無酸(PolyP)作為磷酸供體，可以分別將NAD+和NADH磷酸化并生成NADP+和NADPAD 激酶催化的反應(yīng)是從頭合成 NADP+和 NADPH 的最后一步，同時(shí)也是目前已知
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