發(fā)布時間：2020-10-11 11:52

　　 蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)因?qū)Χ喾N農(nóng)業(yè)害蟲具有特異的殺蟲活性,且對非靶標生物安全、環(huán)境友好等優(yōu)點,使其成為世界上應用最為廣泛的微生物殺蟲劑。其殺蟲活性主要源自于菌株本身所產(chǎn)生的殺蟲蛋白,這些殺蟲蛋白主要由cry基因和vip基因編碼,其中cry基因已被應用于轉(zhuǎn)基因作物20余年。因此,發(fā)掘Bt殺蟲基因?qū)οx的防治具有重要意義。目前殺蟲基因發(fā)掘的主要手段是高通量測序技術(shù),但是由于測序價格較高,且菌株資源庫中的重復菌株較多,會造成較大的資金浪費,迫切需要建立大量菌株的比較分析方法,以去除重復菌株,獲得用于殺蟲基因發(fā)掘的菌株。當大量菌株測序完成后,后續(xù)通常花費較多時間對菌株的基因組測序數(shù)據(jù)組裝和殺蟲基因注釋,因此提高殺蟲基因發(fā)掘效率是十分必要的�，F(xiàn)階段對Bt殺蟲基因的發(fā)掘仍然具有很大需求,由于某些害蟲對現(xiàn)有的Bt殺蟲蛋白不夠敏感,缺少對某些新靶標害蟲具有活性的Bt殺蟲蛋白,以及害蟲對轉(zhuǎn)基因作物表達的Cry蛋白的抗性問題,因此發(fā)掘殺蟲活性高且與轉(zhuǎn)基因作物中的Cry蛋白無交互抗性的新型Bt殺蟲蛋白非常重要。針對上述需求,本論文圍繞Bt菌株分離技術(shù)、殺蟲基因發(fā)掘方法和具有殺蟲活性的Bt新基因的篩選鑒定展開研究,主要結(jié)果如下:1、Bt菌株的分離技術(shù)研究:本研究以基于PCR-RFLP技術(shù)的Bt殺蟲基因指紋圖譜為依據(jù)對分離的大量菌株比較分析。首先對菌株基因組提取方法改良,改用磁珠法DNA提取技術(shù)可以實現(xiàn)快速高通量提取菌株基因組DNA。然后對引物系統(tǒng)改良,增加引物用于檢測更多的殺蟲基因。PCR-RFLP圖譜分析系統(tǒng)改良,利用基于毛細管電泳系統(tǒng)原理的核酸片段分析儀可以分析比較大量菌株的PCR-RFLP圖譜,并且大量菌株的圖譜信息可以以數(shù)字化的形式輸出。進一步結(jié)合生物信息學方法計算菌株P(guān)CR-RFLP圖譜的相似性,最終可以實現(xiàn)對分離的大量菌株中的重復菌株進行去除,獲得可用于進一步殺蟲基因發(fā)掘的菌株。2、Bt菌株混合基因組測序數(shù)據(jù)中殺蟲基因發(fā)掘研究:本研究首先模擬了1個Bt菌株混合基因組原始測序數(shù)據(jù),然后測試了不同基因組組裝軟件的組裝效果,包括單菌基因組組裝軟件(IDBA、Velvet)和宏基因組組裝軟件(IDBA-UD、MetaVelvet),結(jié)果顯示IDBA-UD軟件組裝結(jié)果最佳,獲得的N50及平均序列長度最長。宏基因組基因預測軟件MetaGeneMark預測結(jié)果顯示IDBA-UD組裝結(jié)果對應預測到的編碼基因N50最長。殺蟲基因預測結(jié)果顯示IDBA-UD對應的編碼基因庫中發(fā)掘到的殺蟲基因數(shù)量最多,達到14個Bt菌株殺蟲基因總數(shù)的78%。3、具有殺蟲活性的Bt新基因篩選:本研究利用二代測序技術(shù)分析了78個Bt菌株的基因組,從中獲得了大量與已有殺蟲基因具有相似性的新基因。對部分(96個)新基因進行殺蟲活性篩選,其中包括第一等級的新基因31個,第二等級的新基因48個,第三等級的新基因16個,第四等級的新基因1個。將這些新基因在大腸桿菌中克隆和表達,結(jié)果顯示有92個新基因可在大腸桿菌Rosseta(DE3)中表達。最后對表達的蛋白進行殺蟲活性分析,結(jié)果篩選獲得了1個對鱗翅目害蟲小菜蛾和亞洲玉米螟具有殺蟲活性的新型殺蟲基因cry9C-like,而其余91個新基因?qū)追N常見鱗翅目害蟲和鞘翅目大猿葉甲未表現(xiàn)出殺蟲活性。4、新型Bt殺蟲蛋白Cry9Cb1的鑒定:對上面研究中篩選出的cry9C-like新型殺蟲基因展開研究,首先將基因序列提交至NCBI GenBank中,獲得登錄號MK005301,并被Bt毒素命名委員會命名為cry9Cb1。該基因在Bt無晶體突變株HD73~-中可以表達約130 kDa的蛋白,原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該蛋白為球形晶體蛋白。生物活性測定結(jié)果表明Cry9Cb1對多種鱗翅目害蟲具有很高的殺蟲活性,其中對小菜蛾LC_(50)值為0.38μg/mL,對亞洲玉米螟LC_(50)值為1.28μg/mL,對水稻二化螟LC_(50)值為0.50μg/mL。對小地老虎和東方黏蟲表現(xiàn)出中度的殺蟲活性,LC_(50)值分別為130.22μg/mL和244.77μg/mL。亞洲玉米螟對Cry9Cb1與Cry1Fa不產(chǎn)生交互抗性。Cry9Cb1對小菜蛾的最小活性區(qū)位于72~T~657~V,對亞洲玉米螟的最小活性區(qū)位于68~D~655~A。食用安全性評價結(jié)果表明:Cry9Cb1與已知過敏蛋白無序列同源性,并且在熱處理及模擬胃腸液中快速降解和失活�？偠灾�,本論文從Bt殺蟲基因發(fā)掘上展開研究,發(fā)掘方法的改良對提高Bt殺蟲基因發(fā)掘效率具有重要作用;篩選和鑒定高毒力的新型殺蟲基因?qū)锽t殺蟲劑的改良和Bt轉(zhuǎn)基因作物的研制奠定良好的基礎(chǔ)。
【學位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;TQ453
【部分圖文】：

芽胞桿菌芽胞桿菌簡介桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱 Bt）在專業(yè)分類書籍《伯歸屬于第二類第十八群，兼性厭氧菌，革蘭氏染色呈陽性，的一種[1]。菌體生長前期，菌體形態(tài)呈桿狀。當菌體生長至央可形成一個卵圓形的芽胞，到衰亡期時，芽胞囊破裂，芽，菌體的一端或兩端產(chǎn)生伴胞晶體，此晶體隨芽胞的釋放而描電子顯微鏡下呈現(xiàn)不同形狀，主要為雙錐體形、球形、方稱為殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），對鱗翅ptera）、雙翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（ra）、食毛目（Mallophaga）、線蟲（Nematode）及螨類（Mite于這類蛋白具有殺蟲活性強、對非靶標生物安全且對生態(tài)環(huán)化學殺蟲劑用于防治農(nóng)林害蟲有價值的工具[5-7]。

圖 1-4 目前使用的 Bt 毒素命名體系Figure 1-4 The current used Bt toxin nomenclature system體毒素白是在細菌生長至穩(wěn)定期時產(chǎn)生的伴胞晶體狀物質(zhì)[5, 19]，最為人熟知ry 毒素和 Cyt 毒素。根據(jù)同源性和結(jié)構(gòu)，Cry 蛋白被分成了很多類�；钚缘木w毒素有 Cry 和 Ps 兩種命名，這些蛋白或者屬于三個結(jié)Ps1，Cry41 或 Ps3，Cry63 或 Ps6），或者屬于對人類癌細胞具有特異X2 家族蛋白（Cry45 或 Ps4，Cry46 或 Ps2，Cry64 或 Ps5）[44]。白構(gòu)成了一個較小的獨特晶體蛋白群，這些蛋白對雙翅目幼蟲具有很蚊子和黑蠅[45-49]；除此之外，某些 Cyt 蛋白與其他的 Bt 蛋白具有協(xié)同素白被命名為 Cry 蛋白源于它可以形成一個伴胞晶體（Crystal）。Cry 蛋源家族蛋白，而是包括很多不相關(guān)的類型。最大的一類就是具有三個家族，而其他的 Cry 蛋白則屬于不同的蛋白家族，例如由球形芽胞桿TX_MTX2 類[51, 52]

1-9 害蟲對 Bt 作物產(chǎn)生抗性的全球狀況。每個符號表示 1 個國家的 1 種害蟲對 Bt 轉(zhuǎn)玉米、棉花或大豆中的 1 種毒素的反應[110]。gure 1-9 Global status of pest resistance to Bt crops. Each symbol indicated the responses ofpest species in one country to one toxin in Bt corn, cotton, or soybean[110].
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7 譚思維;發(fā)光桿菌mcf殺蟲基因的克隆和功能研究[D];湖南師范大學;2009年

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10 董明;蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因的鑒定、克隆與表達[D];河北大學;2010年

本文編號：2836555