甘油單酯和二酯脂肪酶是一類具有特殊底物選擇性的脂肪酶,它們幾乎只作用于甘油單酯和甘油二酯底物,而不作用于甘油三酯底物。其特殊的底物選擇特性使其在工業(yè)應(yīng)用中極具潛力。酶蛋白三維結(jié)構(gòu)的解析,有利于深刻理解該類酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系,并為酶的理性改造提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。遺憾的是,目前單酯與二酯脂肪酶晶體結(jié)構(gòu)信息仍然缺乏。本課題以來源于米曲霉的甘油單酯和二酯脂肪酶Aspergillus oryzae lipase(AOL)為研究對象,采用畢赤酵母異源表達(dá)了該脂肪酶并表征了其酶學(xué)性質(zhì),解析了其晶體結(jié)構(gòu),利用定點突變和生物信息學(xué)分析等方法初步研究了AOL結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。主要研究內(nèi)容以及結(jié)果如下:(1)AOL在畢赤酵母中異源表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究。發(fā)酵了AOL組成型表達(dá)的畢赤酵母工程菌株,利用陰離子交換層析對重組AOL進(jìn)行分離純化,SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶不均一。去糖基化酶處理實驗證實,AOL在畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)生了糖基化。酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果顯示:重組AOL的最適溫度為50℃,最適pH為6.0。在中溫(30~50℃)、偏酸性及中性條件下比較穩(wěn)定,最適醇和脂肪酸底物分別為甘油和癸酸。(2)AOL的基因克隆以及在大腸桿菌中異源表達(dá)、純化。為獲得無糖基化修飾的AOL蛋白,將AOL基因克隆至pFL-B13cl表達(dá)載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SHuffle T7中進(jìn)行異源表達(dá)。在15℃、0.4mM IPTG條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)18小時后,大部分SUMOAOL重組蛋白為可溶表達(dá)。利用SUMO蛋白酶酶切結(jié)合鎳柱純化可獲得純度較高的無SUMO蛋白標(biāo)簽的重組AOL蛋白。(3)AOL的晶體結(jié)構(gòu)解析。采用凝膠過濾層析進(jìn)一步純化獲得高純度的AOL蛋白。在蛋白濃度10mg/m L、20℃、0.1M Bis-Tris pH6.4、41%w/v polypropylene glycol P400條件下獲得了具有較高衍射質(zhì)量的晶體。AOL的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:5XK2)通過分子置換的方法得以解析,其分辨率為1.7?。AOL呈現(xiàn)典型的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu),由8個β折疊片和11個α螺旋組成。AOL的催化三聯(lián)體由Ser153、Asp206和His268組成,氧負(fù)離子洞由Ser91和Leu154的主鏈NH基組成。(4)AOL突變體的制備及酶學(xué)性質(zhì)研究。根據(jù)AOL晶體結(jié)構(gòu)的分析和參考已有的研究成果,選擇V269關(guān)鍵位點進(jìn)行定點突變。構(gòu)建獲得了V269I、V269L、V269E、V269Q、V269D、V269R和V269A 7個突變體,并通過畢赤酵母表達(dá)和離子交換層析純化,獲得了較高純度的重組AOL突變體蛋白。甘油二酯底物水解結(jié)果顯示,相比于野生型,親水性氨基酸替代突變體V269D、V269E、V269R、V269Q水解活力分別有6.1、3.0、2.5、1.2倍的增加。甘油和油酸底物酯化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),親水性氨基酸替代突變體V269D、V269E、V269R、V269Q的酯化活力分別有2.6、1.6、1.6、1.4倍的增加。小體積氨基酸替代突變體V269A的水解活力和酯化活力分別有2.3和1.2倍的提高。然而,強疏水性氨基酸替代突變體V269L和V269I的水解活力和酯化活力有輕微的下降。最后,采用了同源模擬和分子對接等生物信息學(xué)手段初步探討了V269位點各個突變體活力變化的原因。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925.6
【部分圖文】：

來除去皮革膠原纖維間及皮毛上的油脂，從而提高產(chǎn)品的彈性和柔軟度[2業(yè)中，脂肪酶不僅可以增加洗滌產(chǎn)品的去污能力，還可以降低洗滌產(chǎn)品對]；在造紙工業(yè)中，脂肪酶可用來除去紙漿中的甘油三酯和蠟酯等疏水性油張的加工過程[22]。肪酶的結(jié)構(gòu)特點然脂肪酶在氨基酸序列和分子大小上可能存在較大的差異，但是它們在空度保守，幾乎呈現(xiàn)相似的 α/β 水解酶折疊。如圖 1-1 所示，典型的 α/β 水 個 β 折疊片和連接這些 β 折疊片的 α 螺旋構(gòu)成。除了 β2 與其它折疊片反向 折疊片都平行分布[23,24]。α/β 水解酶折疊的活性中心由高度保守的催化三氨酸-酸性的天冬氨酸或者谷氨酸-組氨酸）構(gòu)成。親核的絲氨酸通常位于間的 loop 急轉(zhuǎn)彎處，該結(jié)構(gòu)被稱為親核肘，這種繃緊扭曲的結(jié)構(gòu)有利于好的暴露，從而更易進(jìn)攻酯質(zhì)底物碳基正離子發(fā)生水解反應(yīng)[25]。

肪酶的催化機(jī)制催化三聯(lián)體和“蓋子”結(jié)構(gòu)外，脂肪酶還有一個重要的結(jié)構(gòu)原件——“氧負(fù)肪酶行使催化功能起了重要的作用[28]。脂肪酶的催化機(jī)制遵循經(jīng)典的絲機(jī)制，屬于“乒乒乓乓”類型[29]。具體反應(yīng)過程如圖 1-2 所示，當(dāng)酯質(zhì)底酶活性位點結(jié)合后，催化三聯(lián)體中的 His 的咪唑基團(tuán)會奪取親核 Ser 側(cè)使該羥基上的氧原子帶部分負(fù)電。隨后親核 Ser 上帶負(fù)電的羥基氧會親酯鍵中被搶奪了電子的羰基碳正離子，并與底物羰基碳原子結(jié)合形成共原件的“氧負(fù)離子洞”的兩個氨基酸殘基主鏈的酰胺基團(tuán)與底物中帶部氧原子形成氫鍵，從而穩(wěn)定脂肪酶-底物四面體過渡態(tài)。隨后，酯鍵斷裂放離去，親核絲氨酸與底物中的�；糠止矁r結(jié)合形成�；笍�(fù)合體is 會奪取水分子的一個質(zhì)子，形成的 OH-親核進(jìn)攻�；笍�(fù)合體的羰基釋放一個質(zhì)子給絲氨酸，絲氨酸與底物�；糠止矁r鍵斷裂釋放，酶釋次恢復(fù)為游離的狀態(tài)。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文研究內(nèi)容圍繞來源于米曲霉的甘油單酯和二酯脂肪酶 AOL 開展以下研究：AOL 在畢赤酵母中異源表達(dá)以及重組 AOL 的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究；AOL 在大腸桿菌中異源表達(dá)以及重組 AOL 純化；AOL 結(jié)晶條件的篩選、晶體數(shù)據(jù)收集、解析和晶體結(jié)構(gòu)描述；基于 AOL 晶體結(jié)構(gòu)的分析選取可能影響催化功能的關(guān)鍵位點 V269 進(jìn)行設(shè)計突變體；對純化的突變體進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，分析實驗數(shù)據(jù)，采用同源建模和分分析模擬，從蛋白分子結(jié)構(gòu)上探究突變體對酶學(xué)性質(zhì)的影響。技術(shù)路線

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2834142