糖類物質(zhì)作為一種碳水化合物,為生物體提供重要的營養(yǎng)和能量。葡萄糖作為一種單糖,在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝制約著菌體生長和目的產(chǎn)物得率,從而影響工業(yè)生產(chǎn)的成本和效率。類球紅細(xì)菌富含多種營養(yǎng)藥用成分,在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用潛力,但該菌在葡萄糖基質(zhì)中生長緩慢。目前,對(duì)于類球紅細(xì)菌的葡萄糖代謝已有相關(guān)研究,但其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不清楚。本論文以類球紅細(xì)菌2.4.1(Rhodobacter sphaeroies 2.4.1)為研究對(duì)象,旨在闡明葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,提高葡萄糖代謝速率。主要研究結(jié)果如下:(1)葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的檢索及功能預(yù)測(cè)。通過檢索NCBI中類球紅細(xì)菌2.4.1全基因組序列,發(fā)現(xiàn)與葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的兩個(gè)基因:glk和fruA,分別編碼非磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(non-PTS)的葡萄糖激酶(Glk)和磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(PTS)的蛋白EIIBC。(2)glk和fruA基因功能的研究。通過對(duì)Δglk、ΔfruA、ΔglkΔfruA與野生型的表型及搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析:在以葡萄糖為唯一碳源的SMM平板上,突變株ΔfruA長勢(shì)和野生型沒有明顯差異,Δglk和ΔglkΔfruA長勢(shì)較弱。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,在對(duì)數(shù)生長期前期,野生型生長較快;在對(duì)數(shù)生長期中后期,ΔfruA生長最快,Δglk和ΔglkΔfruA生長明顯受到抑制�，F(xiàn)象表明,類球紅細(xì)菌葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)需要依賴PTS和non-PTS系統(tǒng)的共同作用,其中Glk對(duì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用關(guān)鍵。(3)葡萄糖其它跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的探索。突變株ΔglkΔfruA仍能在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中緩慢生長,推測(cè)存在其它跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。經(jīng)生物信息學(xué)分析,葡萄糖進(jìn)入類球紅細(xì)菌2.4.1周質(zhì)空間后,可能經(jīng)葡萄糖脫氫酶(Rsp-2673編碼)作用生成葡萄糖酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)通過無痕敲除,獲得突變株ΔRsp-2673,ΔfruAΔRsp-2673,ΔglkΔfruAΔRsp-2673和ΔglkΔRsp-2673,與野生型進(jìn)行表型和搖瓶發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn),該途徑對(duì)類球紅細(xì)菌葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)影響微弱,其中ΔfruAΔRsp-2673生物量最大。(4)葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的強(qiáng)化。實(shí)驗(yàn)以ΔfruAΔRsp-2673為出發(fā)菌株,分別構(gòu)建了glk、edd、glkE.coli和galPE.coli基因的過表達(dá)菌株。結(jié)果表明:強(qiáng)化non-PTS系統(tǒng),過表達(dá)glk的菌株生長明顯受到抑制;強(qiáng)化ED途徑,過表達(dá)edd的菌株葡萄糖代謝速率有所提高,但前期生長較慢;強(qiáng)化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),過表達(dá)galPEcoli的菌株葡萄糖代謝速率極大提高,并且獲得較大生物量。最終,本論文對(duì)ΔfruAΔRsp-2673-GalP/OP進(jìn)行搖瓶發(fā)酵分析,其生物量較野生型提高70%,耗糖速率提高65%。
【學(xué)位單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

中［１（１１１１，屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，可轉(zhuǎn)運(yùn)２０多種碳水化合物［１２］。通常，該系統(tǒng)由兩種耦逡逑合能量的非專一性蛋白，酶丨（Ｅｌ）邐和磷酸組氨酸搬運(yùn)蛋白操縱子），逡逑以及底物特異性識(shí)別酶ＩＩ邋（ＥＩＩ）邋［１４］組成，典型ＰＴＳ蛋白通透酶組成成分如圖１－２。逡逑？邐？邋■邋＇邋Ａ：：：邋＇邋—邋■．逡逑Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ逡逑媂．：：ｊ邋ｋＳａｉ逡逑＼逡逑１邋ＨＰｒ邋］邐ｓＳＴｅ＇邋－Ｐ逡逑ＰＦＰ邋＾邐＜逡逑Ｐｙｒｕｖａｔｅ逡逑圖１－２典型ＰＴＳ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移原理圖描述［２２］逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｅｐｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ＰＴＳ逡逑ｅｎｚｙｍｅ邋Ｉ，Ｍｇ２—逡逑Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ邋＋邋ＨＰｒ邋邐＞邋ＨＰｒ－Ｚ３邋＋邋Ｐｙｒｕｖａｔｅ逡逑ｅｎｚｙｍｅ邋ＩＩ，邋Ｍｇ２＋逡逑ＨＰｒ－／）邋＋邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邐＞邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－尸邋＋邋ＨＰｒ逡逑圖１－３磷酸化過程反應(yīng)式逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑研究表明，ＰＴＳ蛋白具有的磷酸化狀態(tài)和碳水化合物的可用性以及細(xì)菌自身的能逡逑量狀態(tài)緊密關(guān)聯(lián)。具體而言，ＰＴＳ系統(tǒng)給細(xì)菌提供了一個(gè)完整的代謝機(jī)制，這種代謝逡逑機(jī)制保證細(xì)菌在不同的環(huán)境下仍然能夠最大化的利用碳水化合物。另外

紅細(xì)菌中對(duì)兩種酶ＢＬＡＳＴ發(fā)現(xiàn)，葡萄糖脫氫酶（Ｒｓｐ－２６７３編碼）具有很高一致性，逡逑但未發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸脫氫酶。根據(jù)類球紅細(xì)菌２．４．１數(shù)據(jù)庫，類球紅細(xì)菌以葡萄糖為底逡逑物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝機(jī)制如圖１－８，但其具體轉(zhuǎn)運(yùn)方式尚不明確。逡逑８逡逑

圖２－１邋ｐＬＨ邋１４６圖譜逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＬＨ邋１４６逡逑體邋ｐＬＨ３５９邋（ｐＬＨ１４６：：ｇ／々ＬＲ）的構(gòu)建逡逑尺／ＡＲ白勺獲得逡逑

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