糖類物質(zhì)作為一種碳水化合物,為生物體提供重要的營養(yǎng)和能量。葡萄糖作為一種單糖,在工業(yè)生產(chǎn)中應用最為廣泛。細胞對葡萄糖的轉運和代謝制約著菌體生長和目的產(chǎn)物得率,從而影響工業(yè)生產(chǎn)的成本和效率。類球紅細菌富含多種營養(yǎng)藥用成分,在食品、醫(yī)藥領域具有較高的應用潛力,但該菌在葡萄糖基質(zhì)中生長緩慢。目前,對于類球紅細菌的葡萄糖代謝已有相關研究,但其轉運機制尚不清楚。本論文以類球紅細菌2.4.1(Rhodobacter sphaeroies 2.4.1)為研究對象,旨在闡明葡萄糖跨膜轉運機制,提高葡萄糖代謝速率。主要研究結果如下:(1)葡萄糖跨膜轉運相關基因的檢索及功能預測。通過檢索NCBI中類球紅細菌2.4.1全基因組序列,發(fā)現(xiàn)與葡萄糖跨膜轉運相關的兩個基因:glk和fruA,分別編碼非磷酸轉移系統(tǒng)(non-PTS)的葡萄糖激酶(Glk)和磷酸轉移系統(tǒng)(PTS)的蛋白EIIBC。(2)glk和fruA基因功能的研究。通過對Δglk、ΔfruA、ΔglkΔfruA與野生型的表型及搖瓶發(fā)酵結果分析:在以葡萄糖為唯一碳源的SMM平板上,突變株ΔfruA長勢和野生型沒有明顯差異,Δglk和ΔglkΔfruA長勢較弱。搖瓶發(fā)酵結果表明,在對數(shù)生長期前期,野生型生長較快;在對數(shù)生長期中后期,ΔfruA生長最快,Δglk和ΔglkΔfruA生長明顯受到抑制�，F(xiàn)象表明,類球紅細菌葡萄糖跨膜轉運需要依賴PTS和non-PTS系統(tǒng)的共同作用,其中Glk對跨膜轉運作用關鍵。(3)葡萄糖其它跨膜轉運途徑的探索。突變株ΔglkΔfruA仍能在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中緩慢生長,推測存在其它跨膜轉運途徑。經(jīng)生物信息學分析,葡萄糖進入類球紅細菌2.4.1周質(zhì)空間后,可能經(jīng)葡萄糖脫氫酶(Rsp-2673編碼)作用生成葡萄糖酸進入細胞內(nèi)。實驗通過無痕敲除,獲得突變株ΔRsp-2673,ΔfruAΔRsp-2673,ΔglkΔfruAΔRsp-2673和ΔglkΔRsp-2673,與野生型進行表型和搖瓶發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn),該途徑對類球紅細菌葡萄糖跨膜轉運影響微弱,其中ΔfruAΔRsp-2673生物量最大。(4)葡萄糖跨膜轉運與代謝的強化。實驗以ΔfruAΔRsp-2673為出發(fā)菌株,分別構建了glk、edd、glkE.coli和galPE.coli基因的過表達菌株。結果表明:強化non-PTS系統(tǒng),過表達glk的菌株生長明顯受到抑制;強化ED途徑,過表達edd的菌株葡萄糖代謝速率有所提高,但前期生長較慢;強化跨膜轉運,過表達galPEcoli的菌株葡萄糖代謝速率極大提高,并且獲得較大生物量。最終,本論文對ΔfruAΔRsp-2673-GalP/OP進行搖瓶發(fā)酵分析,其生物量較野生型提高70%,耗糖速率提高65%。
【學位單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

中［１（１１１１，屬于轉運蛋白家族，可轉運２０多種碳水化合物［１２］。通常，該系統(tǒng)由兩種耦逡逑合能量的非專一性蛋白，酶丨（Ｅｌ）邐和磷酸組氨酸搬運蛋白操縱子），逡逑以及底物特異性識別酶ＩＩ邋（ＥＩＩ）邋［１４］組成，典型ＰＴＳ蛋白通透酶組成成分如圖１－２。逡逑？邐？邋■邋＇邋Ａ：：：邋＇邋—邋■．逡逑Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ逡逑媂．：：ｊ邋ｋＳａｉ逡逑＼逡逑１邋ＨＰｒ邋］邐ｓＳＴｅ＇邋－Ｐ逡逑ＰＦＰ邋＾邐＜逡逑Ｐｙｒｕｖａｔｅ逡逑圖１－２典型ＰＴＳ磷酸基團轉移原理圖描述［２２］逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｅｐｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ＰＴＳ逡逑ｅｎｚｙｍｅ邋Ｉ，Ｍｇ２—逡逑Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ邋＋邋ＨＰｒ邋邐＞邋ＨＰｒ－Ｚ３邋＋邋Ｐｙｒｕｖａｔｅ逡逑ｅｎｚｙｍｅ邋ＩＩ，邋Ｍｇ２＋逡逑ＨＰｒ－／）邋＋邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邐＞邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－尸邋＋邋ＨＰｒ逡逑圖１－３磷酸化過程反應式逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑研究表明，ＰＴＳ蛋白具有的磷酸化狀態(tài)和碳水化合物的可用性以及細菌自身的能逡逑量狀態(tài)緊密關聯(lián)。具體而言，ＰＴＳ系統(tǒng)給細菌提供了一個完整的代謝機制，這種代謝逡逑機制保證細菌在不同的環(huán)境下仍然能夠最大化的利用碳水化合物。另外

紅細菌中對兩種酶ＢＬＡＳＴ發(fā)現(xiàn)，葡萄糖脫氫酶（Ｒｓｐ－２６７３編碼）具有很高一致性，逡逑但未發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸脫氫酶。根據(jù)類球紅細菌２．４．１數(shù)據(jù)庫，類球紅細菌以葡萄糖為底逡逑物進行發(fā)酵時，其跨膜轉運及代謝機制如圖１－８，但其具體轉運方式尚不明確。逡逑８逡逑

圖２－１邋ｐＬＨ邋１４６圖譜逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＬＨ邋１４６逡逑體邋ｐＬＨ３５９邋（ｐＬＨ１４６：：ｇ／々ＬＲ）的構建逡逑尺／ＡＲ白勺獲得逡逑

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本文編號：2810689